האָטסטאַרט טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע
הייס אָנהייב טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע (אַנטיבאָדי מאָדיפיקאַטיאָן) איז אַ הייס-אָנהייב טערמאָסטאַבלע דנאַ פּאָלימעראַסע פֿון Thermus aquaticus YT-1, וואָס האט אַ 5′→3′ פּאָלימעראַסע טעטיקייט און אַ 5′ בלאַט ענדאָנוקלעאַסע טעטיקייט.די הייס-אָנהייב טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע איז אַ טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע וואָס איז מאַדאַפייד דורך טערמאַבילע טאַק אַנטיבאָדיעס.אַנטיבאָדי מאָדיפיקאַטיאָן געוואקסן ספּעסיפיקאַטי, סענסיטיוויטי און טראָגן פון פּקר.
קאַמפּאָונאַנץ
| קאָמפּאָנענט | HC1012א-01 | HC1012א-02 | HC1012א-03 | HC1012א-04 |
| 5×הק טאַק באַפער | 4×1 מל | 4×10 מל | 4 × 50 מל | 5 × 400 מל |
| הייס אָנהייב טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע (אַנטיבאָדי מאַדאַפייד) (5 ו / μ ל) | 0.1 מל | 1 מל | 5 מל | 10×5 מל |
אַפּפּליקאַטיאָנס
10 מם טריס-הקל (pH 7.4 ביי 25 ℃), 100 מם קקל, 0.1 מם עדטאַ, 1 מם דיטהיאָטהרעיטאָל, 0.5% טוועענ20, 0.5% יגעפּאַלקאַ-630 און 50% גליסעראָל.
סטאָרידזש צושטאַנד
טראַנספּאָרטאַטיאָן אונטער 0 ° C און זיין סטאָרד בייַ -25 ° C ~ -15 ° C.
אַפּאַראַט דעפֿיניציע
איין אַפּאַראַט איז דיפיינד ווי די סומע פון ענזיים וואָס ינקאָרפּערייט 15 נמאָל פון דנטפּ אין זויער ינסאַליאַבאַל מאַטעריאַל אין 30 מינוט ביי 75 ° C.
קוואַליטעט קאָנטראָל
1.Endאָנוקלאַסע אַקטיוויטעט:ינגקיוביישאַן פון 20 ו פון ענזיים מיט 4 μg pUC19 דנאַ פֿאַר 4 שעה ביי 37 ℃ ריזאַלטיד אין קיין דיטעקטאַבאַל דערנידעריקונג פון די דנאַ ווי באשלאסן דורך געל עלעקטראָפאָרעסיס.
2.5 kb Lambda PCR:25 סייקאַלז פון פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן פון 5 נג לאַמבדאַ דנאַ מיט 1.25 וניץ פון טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע אין דעם בייַזייַן פון 200 μM dNTPs און 0.2 μM אָנפאַנגער רעזולטאַטן אין די דערוואַרט 5 קב פּראָדוקט.
3.עקסאָנוקלעאַס אַקטיוויטעט:ינגקיוביישאַן פון אַ 50 μl אָפּרוף מיט אַ מינימום פון 12.5 ו פון טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע מיט 10 nmol 5'-FAM אָליגאָנוקלעאָטידע פֿאַר 30 מינוט ביי 37 ℃ גיט קיין דיטעקטאַבאַל דערנידעריקונג.
4.רנאַסע אַקטיוויטעט:ינגקיוביישאַן פון 10 μL אָפּרוף מיט 20 ו פון ענזיים מיט 1μג פון רנאַ טראַנסקריפּץ פֿאַר 2 שעה ביי 37 ° C ריזאַלטיד אין קיין דיטעקטאַבאַל דערנידעריקונג פון די רנאַ ווי באשלאסן דורך געל עלעקטראָפאָרעסיס.
5.היץ ינאַקטיוויישאַן:ניין.
רעאַקציע סיסטעם
| קאַמפּאָונאַנץ | באַנד |
| מוסטער דנאַa | אַפּשאַנאַל |
| 10 μם פאָרויס אָנפאַנגער | 0.5 μל |
| 10 μם פאַרקערט אָנפאַנגער | 0.5 μל |
| dNTP מיקס (10 מם יעדער) | 0.5 μל |
| 5×הק טאַק באַפער | 5 μL |
| טאַק דנאַ פּאָלימעראַסעב(5U/μL) | 0.125 μל |
| נוקלעאַסע-פֿרייַ וואַסער | אַרויף צו 25 μ ל |
הערות:
1 ) א .
| דנאַ | סומע |
| גענאָמיק | קסנומקס נג-קסנומקס μג |
| פּלאַזמיד אָדער וויראַל | 1 פּג-1 נג |
2 ) ב.די אָפּטימאַל קאַנסאַנטריישאַן פון טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע קען זיין צווישן 5-50 וניץ / מל (0.1-0.5 וניץ / 25 μL אָפּרוף) אין ספּעשאַלייזד אַפּלאַקיישאַנז.
טערמאַל סייקלינג פּראָטאָקאָל
PCR
| טרעפּל | טעמפּעראַטור(°C) | צייַט | סייקאַלז |
| ערשט דענאַטוראַטיאָןa | 95 ℃ | 1-3 מינוט | - |
| דענאַטוראַטיאָן | 95 ℃ | 15-30 ס | 30-35 סייקאַלז |
| אַנילינגב | 45-68 ℃ | 15-60 ס | |
| פאַרלענגערונג | 68 ℃ | 1קב / מין | |
| לעצט פאַרלענגערונג | 68 ℃ | 5 מינס | - |
הערות:
1) אַן ערשט דינאַטוראַטיאָן פון 1 מין ביי 95 ° C איז גענוג פֿאַר רובֿ אַמפּלאַפאַקיישאַנז.פֿאַר שווער טעמפּלאַטעס, אַ מער דענאַטוראַטיאָן פון 2-3 מינוט ביי 95 ° C איז רעקאַמענדיד.מיט קאַלאַני פּקר, אַן ערשט 5-מינס דינאַטוריישאַן ביי 95 ° C איז רעקאַמענדיד.
2) די אַנילינג שריט איז טיפּיקלי 15-60 ס.אַנילינג טעמפּעראַטור איז באזירט אויף די טם פון די אָנפאַנגער פּאָר און איז טיפּיקלי 45-68 ℃.
