ווילד טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע
טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע איז אַ טערמאַסטיבאַל דנאַ פּאָלימעראַסע פֿון Thermus aquaticus YT-1, וואָס פארמאגט אַ 5′→3′ פּאָלימעראַסע טעטיקייט און אַ 5′ בלאַט ענדאָנוקלעאַסע טעטיקייט.
קאַמפּאָונאַנץ
| קאָמפּאָנענט | HC1010א-01 | HC1010א-02 | HC1010א-03 | HC1010א-04 |
| 10× טאַק באַפער | קסנומקס × קסנומקס מל | 2×10 מל | 2×50 מל | 5 × 200 מל |
| טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע (5 ו / μ ל) | 0.1 מל | 1 מל | 5 מל | 5 × 10 מל |
סטאָרידזש צושטאַנד
טראַנספּאָרטאַטיאָן אונטער 0 ° C און זיין סטאָרד בייַ -25 ° C ~ -15 ° C.
אַפּאַראַט דעפֿיניציע
איין אַפּאַראַט איז דיפיינד ווי די סומע פון ענזיים וואָס ינקאָרפּערייט 15 נמאָל פון דנטפּ אין זויער ינסאַליאַבאַל מאַטעריאַל אין 30 מינוט ביי 75 ° C.
קוואַליטעט קאָנטראָל
1.פּראָטעין ריינקייַט אַססייַ (SDS-PAGE):די ריינקייַט פון טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע איז ≥ 95% באשלאסן דורך SDS-PAGE אַנאַליסיס.
2.Endאָנוקלאַסע אַקטיוויטעט:א מינימום פון 5 ו פון טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע מיט 1 μג λ דנאַ פֿאַר 16 שעה ביי 37 ℃ רעזולטאַטן אין קיין דיטעקטאַבאַל דערנידעריקונג ווי באשלאסן.
3.עקסאָנוקלעאַס אַקטיוויטעט:א מינימום פון 5 ו פון טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע מיט 1 μg λ -Hind Ⅲ דיידזשעסטיד דנאַ פֿאַר 16 שעה ביי 37 ℃ רעזולטאַטן אין קיין דיטעקטאַבאַל דערנידעריקונג ווי באשלאסן.
4.ניקאַסע אַקטיוויטעט:א מינימום פון 5 ו פון טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע מיט 1 μg pBR322 דנאַ פֿאַר 16 שעה ביי 37 ° C רעזולטאַטן אין קיין דיטעקטאַבאַל דערנידעריקונג ווי באשלאסן.
5.רנאַסע אַקטיוויטעט:א מינימום פון 5 ו פון טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע מיט 1.6 μג MS2 רנאַ פֿאַר 16 שעה ביי 37 ° C רעזולטאַטן אין קיין דיטעקטאַבאַל דערנידעריקונג ווי באשלאסן.
6.E. קאָלידנאַ:5 ו פון טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע איז סקרינד פֿאַר די בייַזייַן פון E. קאָלי גענאָמיק דנאַ ניצן TaqMan qPCR מיט פּרימערז ספּעציפיש פֿאַר די E. קאָלי 16S רRNA לאָקוס.די E. קאָלי גענאָמיק דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן איז ≤1 קאָפּי.
7.PCR Amplification (5.0 קב לאַמבדאַ דנאַ)- א 50 μL אָפּרוף מיט 5 נג לאַמבדאַ דנאַ מיט 5 וניץ פון טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע פֿאַר 25 סייקאַלז פון פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן רעזולטאַטן אין די דערוואַרט 5.0 קב פּראָדוקט.
רעאַקציע סעטאַפּ
| קאַמפּאָונאַנץ | באַנד |
| מוסטער דנאַa | אַפּשאַנאַל |
| 10 μם פאָרויס אָנפאַנגער | 1 μל |
| 10 μם פאַרקערט אָנפאַנגער | 1 μל |
| dNTP מיקס (10 מם יעדער) | 1 μל |
| 10×טאַק באַפער | 5 μL |
| טאַק דנאַ פּאָלימעראַסעב | 0.25 μל |
| נוקלעאַסע-פֿרייַ וואַסער | אַרויף צו 50 μ ל |
הערות:
1) די אָפּטימאַל אָפּרוף קאַנסאַנטריישאַן פון פאַרשידענע טעמפּלאַטעס איז אַנדערש.די פאלגענדע טיש ווייזט די רעקאַמענדיד מוסטער באַניץ פון 50 μL אָפּרוף סיסטעם.
| דנאַ | סומע |
| גענאָמיק | קסנומקס נג-קסנומקס μג |
| פּלאַזמיד אָדער וויראַל | 1 פּג-1 נג |
2) די אָפּטימאַל קאַנסאַנטריישאַן פון טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע קען זיין צווישן 0.25 μL ~ 1 μL אין ספּעשאַלייזד אַפּלאַקיישאַנז.
אָפּרוףפּראָגראַם
| טרעפּל | טעמפּעראַטור(°C) | צייַט | סייקאַלז |
| ערשט דענאַטוראַטיאָןa | 95 ℃ | 5 מינס | - |
| דענאַטוראַטיאָן | 95 ℃ | 15-30 ס | 30-35 סייקאַלז |
| אַנילינגב | 60 ℃ | 15 ס | |
| פאַרלענגערונג | 72 ℃ | 1קב / מין | |
| לעצט פאַרלענגערונג | 72 ℃ | 5 מינס | - |
הערות:
1) דער ערשט דענאַטוראַטיאָן צושטאַנד איז פּאַסיק פֿאַר רובֿ אַמפּלאַפאַקיישאַן ריאַקשאַנז און קענען זיין מאַדאַפייד לויט די קאַמפּלעקסיטי פון מוסטער סטרוקטור.אויב די מוסטער סטרוקטור איז קאָמפּליצירט, די פאַר-דענאַטוראַטיאָן צייט קענען זיין עקסטענדעד צו 5 - 10 מינוט צו פֿאַרבעסערן די ערשט דענאַטוראַטיאָן ווירקונג.
2) די אַנילינג טעמפּעראַטור דאַרף זיין אַדזשאַסטיד לויט די טם ווערט פון די אָנפאַנגער, וואָס איז בכלל באַשטימט צו 3 ~ 5 ℃ נידעריקער ווי די טם ווערט פון די אָנפאַנגער;פֿאַר קאָמפּלעקס טעמפּלאַטעס, עס איז נייטיק צו סטרויערן אַנילינג טעמפּעראַטור און פאַרברייטערן די פאַרלענגערונג צייט צו דערגרייכן עפעקטיוו אַמפּלאַפאַקיישאַן.
