פּלאַנט דירעקט פּקר קיט
קאַץ נומער: HCR2020A
פּלאַנט דירעקט פּקר קיט איז פּאַסיק פֿאַר דירעקט אַמפּלאַפאַקיישאַן פון פּלאַנט בלעטער, זאמען, אאז"ו ו, און קענען זיין געוויינט פֿאַר הויך-טראַפּוט זיפּונג פון פאַבריק סאַמפּאַלז וואָס טאָן ניט אַנטהאַלטן פּאָליסאַקשאַרידעס און פּאָליפענאָלס.די דירעקט אַמפּלאַפאַקיישאַן דנאַ פּאָלימעראַסע באזירט אויף די דירעקטעד עוואָלוציע האט העכער טאָלעראַנץ צו פּקר ינכיבאַטערז אין געוויקסן.דערווייַל, עס מיינטיינז די הויך אַמפּלאַפאַקיישאַן פאָרשטעלונג, וואָס איז פּאַסיק פֿאַר די אַמפּלאַפאַקיישאַן פון דנאַ פראַגמאַנץ ין 5 קב.די יינציק ליסיס באַפער א אין די קיט קענען ווערן גענוצט צו לייזירן פריש אָדער פאַרפרוירן פאַבריק געוועבן.עס איז גרינג צו אַרבעטן און די ליסאַטע קענען זיין געוויינט ווי אַ מוסטער פֿאַר אַמפּלאַפאַקיישאַן אָן רייניקונג.די סיסטעם כּולל פּראַטעקטיוו אגענטן וואָס געבן גראָב סאַמפּאַלז צו זיין יפעקטיוולי אַמפּלאַפייד נאָך ריפּיטיד ייַז קאַלט און טאָינג.2 × פּלאַנט דירעקט האר מיקס נאָר דאַרף צו לייגן אָנפאַנגער און טעמפּלאַטעס צו דורכפירן אַמפּלאַפאַקיישאַן אָפּרוף, דערמיט רידוסינג פּיפּעטטינג אַפּעריישאַנז און ימפּרוווינג דיטעקשאַן טרופּוט און רעפּראָדוסיביליטי פון רעזולטאַטן.
קאַמפּאָונאַנץ
| קאַמפּאָונאַנץ | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × פּלאַנט דירעקט האר מיקס | 1.25 מל | 4 × 1.25 מל |
| פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער א | 5 מל | 20 מל |
| פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער ב * | 5 מל | 20 מל |
* פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער ב איז אַ אַפּשאַנאַל רייידזשאַנט וואָס איז געניצט צו נוטראַלייז פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער א פֿאַר פאַרלענגערונג פון די סטאָרידזש צייט פון סאַמפּאַלז.עס קענען זיין געוויינט לויט די פאַקטיש סיטואַציע.
סטאָרידזש טנאָים
2 × פּלאַנט דירעקט האר מיקס, קראָם ביי -30 ~ -15 ℃ און ויסמיידן ריפּיטיד ייַז קאַלט און טאָינג;פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער, קראָם ביי -30 ~ -15 ℃ אָדער 2 ~ 8 ℃.
עקספּערימענט פּראָצעס
מוסטער פּראַסעסינג—פּלאַנט בלאַט
דירעקט אופֿן:עס איז רעקאַמענדיד צו נוצן יונג בלעטער.ניצן אַ לאָך זעץ מיט אַ פאַרפעסטיקט דיאַמעטער פון 0.5 - 3 מם צו קריגן אַ קליין און מונדיר מוסטער, און דעריבער לייגן די מוסטער גלייַך צו די פּקר סיסטעם (50 μל סיסטעם איז רעקאַמענדיד).באַמערקונג, מאַכן זיכער אַז די מוסטער איז אין די פּקר לייזונג און נישט קעגן די רער וואַנט.אויב דירעקט פּקר איז געניצט צו אַמפּלאַפיי לאַנג פראַגמאַנץ און קאָמפּלעקס סאַמפּאַלז, ניצן אַ מוסטער מיט אַ קלענערער דיאַמעטער (0.5 - 1 מם) ווי אַ מוסטער קענען העלפֿן צו באַקומען בעסער רעזולטאַטן.
גרינדינג ליסיס אופֿן:עס איז רעקאַמענדיד צו נוצן יונג בלעטער.נעמען אַ קליין שטיק פון בלאַט (וועגן 1-3 מם אין דיאַמעטער), שטעלן עס אין 20 μל פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער אַב, און מאָל עס ווי פיל ווי מעגלעך (דעם שריט קענען זיין דורכגעקאָכט דורך סקוויזינג די בלאַט מיט אַ 100 μל פּיפּעטטע שפּיץ צו צעקוועטשן די מוסטער).אויב גרעסערע וואַליומז פון בלאַט געוועב זענען געניצט (טאָן ניט יקסיד 7 מם), פאַרגרעסערן די באַנד פון דיילושאַן באַפער צו 50 μל.נאָך די בלעטער זענען ערד, די לייזונג זאָל דערשייַנען גרין.נאָך אַ קורץ סענטריפוגיישאַן, לייגן 1 μl פון די סופּערנאַטאַנט צו די פּקר סיסטעם ווי אַ אָפּרוף טעמפּלאַטע.
טערמאַל ליסיס אופֿן:עס איז רעקאַמענדיד צו נוצן יונג בלעטער.נעמען אַ קליין שטיק פון בלאַט (וועגן 1 - 3 מם אין דיאַמעטער), שטעלן עס אין 20 μל פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער א, און היץ עס בייַ 95 ° C פֿאַר 5 - 10 מינוט.די ליסיס צייט קענען זיין אַפּראָופּרייטלי עקסטענדעד פֿאַר בלעטער וואָס זענען שווער צו לייז (ניט מער ווי 20 מינוט).אויב גרעסערע וואַליומז פון בלאַט געוועב זענען געניצט (טאָן ניט יקסיד 7 מם), פאַרגרעסערן די באַנד פון דיילושאַן באַפער צו 50 μל.נאָך באַהיצונג, סענטריפודזש בעקיצער, און לייגן 1 μל סופּערנאַטאַנט צו די פּקר סיסטעם ווי אַ אָפּרוף מוסטער.
מוסטער פּראַסעסינג- פּלאַנט זוימען
גרינדינג ליסיס אופֿן:ניצן אַ סקאַלפּעל צו שנייַדן זאמען מיט אַ דיאַמעטער פון 5 מם, לייגן זיי צו 100 μל פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער א, און מאָל די מוסטער מיט אַ פּיפּעטטע שפּיץ אָדער אנדערע מכשירים.וואָרטעקס בעקיצער און לאָזן שטיין אין צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 3-5 מינוט.מאַכן זיכער אַז די זוימען מוסטער איז סאַבמערדזשד אין די דיילושאַן באַפער.נאָך אַ קורץ סענטריפוגיישאַן, לייגן 1 μל פון די סופּערנאַטאַנט צו די פּקר סיסטעם ווי אַ אָפּרוף מוסטער.
טערמאַל ליסיס אופֿן:ניצן אַ סקאַלפּעל צו שנייַדן זאמען מיט אַ דיאַמעטער פון 5 מם, לייגן זיי צו 100 μל פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער א, און היץ ביי 95 ° C פֿאַר 5-10 מינוט.די ליסיס צייט קענען זיין אַפּראָופּרייטלי עקסטענדעד פֿאַר בלעטער וואָס זענען שווער צו לייז (ניט מער ווי 30 מינוט).נאָך באַהיצונג, סענטריפודזש בעקיצער און לייגן 1 μl סופּערנאַטאַנט צו די פּקר סיסטעם ווי אַ אָפּרוף מוסטער.
א.שער אָדער אנדערע מכשירים קענען אויך זיין געניצט צו שנייַדן סאַמפּאַלז פון פּאַסיק גרייס;אויב די זעץ אָדער שער זענען ריוזד, זיי זאָל זיין קלינד מיט 2% סאָדיום היפּאָטשלאָריט לייזונג איידער יעדער נוצן צו פאַרמייַדן קרייַז-קאַנטאַמאַניישאַן צווישן סאַמפּאַלז.
ב.מאַכן זיכער אַז די פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער איז גאָר צעלאָזן איידער נוצן.אויב דער באַפער איז וויסקאַס אָדער האט פּרעסיפּיטאַטעס, עס קענען זיין העאַטעד צו 37 ℃ צו צעשמעלצן עס גאָר איידער נוצן.
ג.דער באַנד פון מוסטער אין די אָפּרוף סיסטעם קענען זיין אַדזשאַסטיד אַפּראָופּרייטלי לויט די חילוק אין די באַנד פון פאַבריק מאַטעריאַל און דילוענט צוגעגעבן.
פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער
די פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער א קאַנטיינד אין דעם פּראָדוקט איז שטרענג אָפּטימיזעד צו באַפרייַען די גענאָמע פון רובֿ פאַבריק געוועבן און איז פּאַסיק פֿאַר קורץ-טערמין סטאָרידזש פון גראָב געוויקסן ביי 4 ℃.אויב די מוסטער דאַרף זיין סטאָרד פֿאַר אַ מער צייט (למשל, 1-2 חדשים), עס איז רעקאַמענדיד צו אַריבערפירן די סופּערנאַטאַנט צו אַ נייַע עפּ רער און קראָם עס ביי -20 ℃.צו סטאָרד די סאַמפּאַלז מער סטאַביל, לייגן אַן גלייַך באַנד פון פּלאַנט דירעקט ליסיס באַפער ב צו די טראַנספערד סופּערנאַטאַנט, מישן געזונט און קראָם ביי -20 ℃.די סטאַביל סטאָרידזש צייט וועריז מיט פאַבריק סאַמפּאַלז און שטאַטן.
רעאַקציע סיסטעם
| ddH2O | צו 20.0 μל | צו 50.0 μל |
| 2 × פּלאַנט דירעקט האר מיקסa | 10.0 μל | 25.0 µ |
| אָנפאַנגער 1 (10 μM) | 0.8 μל | 2.0 μל |
| אָנפאַנגער 2 (10 μM)b | 0.8 μל | 2.0 μל |
| פּלאַנט בלאַט / גראָב עקסטראַקט מוסטער(אָפּשיקן צו מוסטער פּראַסעסינג) | 0.5 - 3 מם בלאַט דיסק / רענטגענ μל | 0.5 - 3 מם בלאַט דיסק / רענטגענ μל |
א.עס כּולל מג2+אין אַ לעצט קאַנסאַנטריישאַן פון 2 מם.
ב.עס איז רעקאַמענדיד צו נוצן אַ לעצט קאַנסאַנטריישאַן פון 0.4μם פֿאַר יעדער אָנפאַנגער.יבעריק נוצן פון פּרימערז וועט פירן צו אַ געוואקסן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.
ג.די סומע פון מוסטער געניצט קענען זיין אַדזשאַסטיד לויט די פאַקטיש סיטואַציע.די סומע געניצט אין אַ איין אָפּרוף פון גראָב ליסעד מוסטער קענען זיין אַדזשאַסטיד צווישן 2% - 20% פון די גאַנץ באַנד פון דער אָפּרוף.ניצן צו פיל סאַמפּאַלז קענען גרונט אַמפּלאַפאַקיישאַן דורכפאַל.
אָפּרוף פּראָגראַם
| סטעפּס | טעמפּעראַטור | צייַט |
| ערשט דענאַטוראַטיאָן | 98℃ | 5 מין |
| דענאַטוראַטיאָן | 95℃ | 10 סעק |
| אַנילינג | 58 ~ 72℃ | 15 סעק |
| פאַרלענגערונג | 72℃ | 30 סעק |
| לעצט פאַרלענגערונג | 72℃ | 5 מין |
א.ערשט דענאַטוראַטיאָן (98 ℃, 5 מין) פּראַמאָוץ ליסיס פון פאַבריק געוועב, ריליסינג גענאָמיק דנאַ וואָס קענען זיין געוויינט פֿאַר פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן.דו זאלסט נישט פאַרקירצן די צייט אָדער פאַרמינערן די טעמפּעראַטור.
ב.עס איז רעקאַמענדיד צו שטעלן עס גלייַך צו די אָנפאַנגער טם ווערט אָדער 2 ~ 4 ℃ העכער ווי די טם ווערט.די דירעקט אַמפּלאַפאַקיישאַן דנאַ פּאָלימעראַסע געניצט אין דעם פּראָדוקט איז אַנדערש פון קאַנווענשאַנאַל טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע, און האט ספּעציעל רעקווירעמענץ פֿאַר די אָפּרוף אַנילינג טעמפּעראַטור; די נוצן פון הויך אַנילינג טעמפּעראַטור קענען יפעקטיוולי רעדוצירן נאַנספּאַסיפיק אַמפּלאַפאַקיישאַן און פֿאַרבעסערן די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט.פֿאַר קאָמפּלעקס טעמפּלאַטעס, די עפעקטיוו אַמפּלאַפאַקיישאַן קענען זיין אַטשיווד דורך אַדזשאַסטינג אַנילינג טעמפּעראַטור און פאַרלענגערונג צייט.
ג.אויב די לענג פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט איז ≤1 קב, די פאַרלענגערונג צייט איז באַשטימט צו 30 סעק / קב;אויב די לענג פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט איז> 1 קב, די פאַרלענגערונג צייט איז באַשטימט צו 60 סעק / קב.
ד.פֿאַר קאָמפּלעקס סאַמפּאַלז אָדער סאַמפּאַלז מיט נידעריק אַמפּלאַפאַקיישאַן טראָגן, די נומער פון סייקאַלז קענען זיין אַפּראָופּרייטלי געוואקסן צו 40 -50 סייקאַלז.
אַפּפּליקאַטיאָנס
עס איז אָנווענדלעך פֿאַר דירעקט אַמפּלאַפאַקיישאַן פון פאַבריק געוועבן און הויך-טראַפּוט זיפּונג פון פאַבריק סאַמפּאַלז וואָס טאָן ניט אַנטהאַלטן פּאָליסאַקשאַרידעס און פּאָליפענאָלס.
הערות
פֿאַר פאָרשונג נוצן בלויז.ניט פֿאַר נוצן אין דיאַגנאָסטיק פּראָוסידזשערז.
1. פֿאַר גראָב פאַבריק אַמפּלאַפאַקיישאַן אָדער דירעקט אַמפּלאַפאַקיישאַן, עס איז רעקאַמענדיד צו נוצן פּיוראַפייד גענאָמיק דנאַ ווי אַ positive קאָנטראָל איידער איר אָנהייבן דעם עקספּערימענט צו ענשור אַז די סיסטעם, אָנפאַנגער און אַפּעריישאַנז זענען ריכטיק.
2. די דירעקט אַמפּלאַפאַקיישאַן דנאַ פּאָלימעראַסע געניצט אין דעם קיט האט שטאַרק פּרופרידינג טעטיקייט.אויב TA קלאָונינג דאַרף זיין דורכגעקאָכט, עס איז רעקאַמענדיד צו רייניקן די דנאַ איידער אַדינג די אַדענינע.
3. אָנפאַנגער פּלאַן גיידאַנס:
א.עס איז רעקאַמענדיד אַז די לעצטע באַזע אין די 3′ סוף פון די אָנפאַנגער זאָל זיין G אָדער C.
ב.קאָנסעקוטיווע מיסמאַטשעס זאָל זיין אַוווידיד אין די לעצטע 8 באַסעס אין די 3′ סוף פון די אָנפאַנגער.ג.ויסמיידן האַירפּין סטראַקטשערז אין די 3′ סוף פון די אָנפאַנגער.
ד.דיפעראַנסיז אין די טם ווערט פון די פאָרויס אָנפאַנגער און די פאַרקערט אָנפאַנגער זאָל זיין ניט מער ווי 1 ℃ און די טם ווערט זאָל זיין אַדזשאַסטיד צו 60 ~ 72 ℃ (פּרימער פּרעמיער 5 איז רעקאַמענדיד צו רעכענען די טם ווערט).
E.עקסטרע נאָך אָנפאַנגער סיקוואַנסיז וואָס זענען נישט מאַטשט מיט די מוסטער, זאָל ניט זיין אַרייַנגערעכנט ווען קאַלקיאַלייטינג די אָנפאַנגער טם ווערט.
f.עס איז רעקאַמענדיד אַז די GC אינהאַלט פון די אָנפאַנגער איז 40% -60%.
ג.די קוילעלדיק פאַרשפּרייטונג פון A, G, C און T אין די אָנפאַנגער זאָל זיין ווי אפילו ווי מעגלעך.ויסמיידן מקומות מיט הויך GC אָדער AT אינהאַלט.
ה.ויסמיידן די בייַזייַן פון קאַמפּלאַמענטשי סיקוואַנסיז פון 5 אָדער מער באַסעס אין די אָנפאַנגער אָדער צווישן צוויי אָנפאַנגער און ויסמיידן די בייַזייַן פון קאַמפּלאַמענטשי סיקוואַנסיז פון 3 אָדער מער באַסעס אין די 3′ סוף פון צוויי אָנפאַנגער.
איך.ניצן די NCBI BLAST פונקציע צו קאָנטראָלירן די ספּעציפֿישקייט פון די אָנפאַנגער צו פאַרמייַדן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.
