ענדאָפרעע פּלאַסמיד מאַקסי קיט
דעם קיט איז פּאַסיק פֿאַר יקסטראַקשאַן פון 150-300 מל פון באַקטיריאַל לייזונג געבילדעטער יבערנאַכטיק, ניצן אַ ימפּרוווד SDS-אַלקאַליין ליסיס אופֿן צו ליס די באַקטיריאַ.די גראָב עקסטראַקט איז סאַלעקטיוולי קאַמביינד מיט אַ יינציק ענדאָטאָקסין סקאַוואַנדזשער און אפגעשיידט דורך סענטריפוגיישאַן צו באַזייַטיקן ענדאָטאָקסינס.דערנאָך, די סילאַקאַ געל מעמבראַנע סאַלעקטיוולי ביינדז צו פּלאַסמיד דנאַ אין די לייזונג אונטער טנאָים פון הויך-זאַלץ און נידעריק-פּה.דעם איז נאכגעגאנגען דורך אַדישאַן פון וואַשינג באַפער צו באַזייַטיקן ימפּיוראַטיז און אנדערע באַקטיריאַל קאַמפּאָונאַנץ.צום סוף, אַ נידעריק-זאַלץ, הויך-פּה ילושאַן באַפער איז געניצט צו ילוטע ריין פּלאַזמיד דנאַ פון די סיליציום מאַטריץ מעמבראַנע.די סילאַקאַ געל מעמבראַנע ניצט ספּעציעל אַדסאָרפּטיאָן מעמבראַנע, און די אַדסאָרפּטיאָן סומע חילוק צווישן די זייַל און די זייַל איז זייער קליין און די ריפּיטאַביליטי איז גוט.פענאָל, טשלאָראָפאָרם און אנדערע טאַקסיק רייידזשאַנץ זענען נישט פארלאנגט, און עטאַנאָל אָפּזאַץ סטעפּס אויך נישט.דעם קיט קענען זיין גענוצט צו געשווינד עקסטראַקט 0.2-1.5 מג פון ריין הויך-קאָפּיע פּלאַזמיד דנאַ, מיט אַ יקסטראַקשאַן קורס פון 80% -90%.די קיט ניצט אַ יינציק פּראָצעס פאָרמולע רימוווז ענדאָטאָקסין, דער אינהאַלט פון ענדאָטאָקסין איז גאָר נידעריק און די צעל טראַנספעקשאַן ווירקונג איז ויסגעצייכנט.די יקסטראַקטיד פּלאַסמיד קען זיין גלייך געניצט אין ענזיים דיידזשעסטשאַן, פּקר, אין וויטראָ טראַנסקריפּציע, טראַנספאָרמאַציע, סיקוואַנסינג און אנדערע מאָלעקולאַר ביאָלאָגי יקספּעראַמאַנץ.
סטאָרידזש טנאָים
רנאַסעאַ זאָל זיין סטאָרד ביי -30 ~ -15 ℃ און טראַנספּאָרטאַד בייַ ≤ 0 ℃.
ענדאָטאָקסין סקאַוואַנדזשער קענען זיין סטאָרד ביי 2 ~ 8 ℃ פֿאַר איין חודש, סטאָרד אין -30 ~ -15 ℃ פֿאַר לאַנג-טערמין סטאָרידזשאון טראַנספּאָרטאַד בייַ ≤0℃.
אנדערע קאַמפּאָונאַנץ זאָל זיין סטאָרד אין צימער טעמפּעראַטור (15 ~ 25 ℃) און טראַנספּאָרטאַד אין צימער טעמפּעראַטור.
קאַמפּאָונאַנץ
| קאַמפּאָונאַנץ | 10RXNS |
| רנאַסע א | 750 μל |
| באַפער פּ1 | 75 מל |
| באַפער פּ2 | 75 מל |
| באַפער פּ4 | 75 מל |
| ענדאָטאָקסין סקאַוואַנדזשער | 25 מל |
| Buffer PW | 2 × 22 מל |
| באַפער טב | 20 מל |
| FastPure DNA Maxi Columns (יעדער אין אַ 50 מל זאַמלונג רער) | 10 |
| ענדאָטאָקסין-פֿרייַ זאַמלונג רער | 2 × 5 |
RNAseA:10 מג / מל, געניצט צו באַזייַטיקן רנאַ.
באַפער P1:באַקטיריאַל סאַספּענשאַן באַפער, לייגן RNAseA צו Buffer P1 איידער ערשטער נוצן.
באַפער P2:באַקטעריע ליסיס באַפער (מיט SDS / NaOH).
באַפער P4:נוטראַלייזינג באַפער.
ענדאָטאָקסין סקאַוואַנדזשער:יפעקטיוולי באַזייַטיקן ענדאָטאָקסין פון די גראָב פּלאַזמיד עקסטראַקט.
Buffer PW:וואַשן באַפער, לייגן די סטיפּיאַלייטיד באַנד פון עטאַנאָל איידער ערשטער נוצן.
באַפער טב:elution buffer.
FastPure DNA Maxi Columns:פּלאַסמיד דנאַ אַדסאָרפּטיאָן שפאלטן.
זאַמלונג טובז 50 מל:פילטראַטע זאַמלונג טובז.
ענדאָטאָקסין-פריי זאַמלונג רער:פּלאַסמיד דנאַ זאַמלונג טובז.
צוגעגרייט מאַטעריאַלס
אַבסאָלוט עטאַנאָל, יסאָפּראָפּאַנאָל, 50 מל ראָונד-דנאָ סענטריפודזש טובז און 50 מל ענדאָטאָקסין-פֿרייַסענטריפודזש טובז.
אַפּפּליקאַטיאָנס
דער פּראָדוקט איז פּאַסיק פֿאַר גרויס-וואָג יקסטראַקשאַן פון פּלאַזמידס פון 150-300 מל פון באַקטיריאַל לייזונגגעבילדעטע יבערנאַכטיק.
עקספּערימענט פּראָצעס
1. נעמען 150 - 200 מל (ניט מער ווי 300 מל) פון באַקטיריאַל לייזונג געבילדעטער יבערנאַכטיק און סענטריפודזשוועגן 11,000 רפּם (12,000 × ג) פֿאַר 1-2 מינוט.אַוועקוואַרפן די סופּערנאַטאַנט און קלייַבן באַקטיריאַ.
Δ ווען קאַלעקטינג מער ווי 50 מל פון באַקטיריאַל לייזונג, די באַקטיריאַ קענען זיין געזאמלט דורך אַדינג באַקטיריאַל לייזונג, סענטריפוגאַטיאָן, אַוועקוואַרפן די סופּערנאַטאַנט און אנדערע סטעפּס אין דער זעלביקער 50 מל רער פֿאַר
קייפל מאל.
2. לייג 7.5 מל פון Buffer P1 (ביטע טשעק צי רנאַסעאַ איז צוגעגעבן צו Buffer P1) צו די סענטריפודזשרער מיט באַקטיריאַ און מישן ונ דורך דורך וואָרטעקס אָדער פּיפּעטטינג.
Δ די פולשטענדיק ריסאַספּענשאַן פון באַקטיריאַ אין דעם שריט איז קריטיש צו טראָגן, און עס זאָל זיין קיין באַקטיריאַל קלאַמפּס נאָך ריסאַספּענשאַן.אויב עס זענען באַקטיריאַל קלאַמפּס וואָס זענען נישט ונ דורך געמישט, דאָס וועט ווירקן די ליסיס, ריזאַלטינג אין נידעריק טראָגן און ריינקייַט.אויב די OD600 פון באַקטיריאַל לייזונג איז 0.65, עס איז רעקאַמענדיד צו נוצן 7.5 מל פון Buffer P1 ווען עקסטראַקט פון 150 מל פון באַקטיריאַל לייזונג;ווען OD600 איז 0.75, 8 מל פון Buffer P1 זאָל זיין געוויינט און די וואַליומז פון Buffers P2 און P4 זאָל זיין געביטן אַקאָרדינגלי.אויב די באַנד פון די באַקטיריאַל לייזונג איז געוואקסן צו 200 מל, עס איז רעקאַמענדיד אַז דידי באַנד פון באַפער P1, P2 און P4 זאָל זיין געוואקסן פּראַפּאָרשאַנאַל.
3. לייג 7.5 מל פון Buffer P2 צו די באַקטיריאַל סאַספּענשאַן פון שריט 2 און מישן דזשענטלי אַרויף און אַראָפּ פֿאַר 6-8מאל און ינגקיובייט אין צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 4-5 מינוט.
Δ יבערקערן דזשענטלי צו מישן ונ דורך.וואָרטעקסינג וועט פאַרשאַפן די גענאָמיק דנאַ פראַגמאַנטיישאַן, ריזאַלטינג אין גענאָמיק דנאַ פראַגמאַנץ אין די יקסטראַקטיד פּלאַזמיד.אין דעם צייַט, די לייזונג ווערט וויסקאַס און טראַנסלוסאַנט, ווייַזונג אַז די באַקטיריאַ זענען גאָר ליסעד.דער געדויער זאָל נישט יקסיד 5 מינוט צו ויסמיידן צעשטערונג פון די פּלאַסמיידז.אויב די לייזונג איז נישט קלאָר, עס קען זיין צו פילע באַקטיריאַדערענדיקט ליסיס, אַזוי די סומע פון באַקטיריאַ זאָל זיין רידוסט אַפּראָופּרייטלי.
4. לייג 7.5 מל פון Buffer P4 צו די באַקטיריאַל סאַספּענשאַן פון סטעפּ 3 און מיד יבערקערן דזשענטלי 6-8 מאל צו לאָזן די לייזונג גאָר נוטראַלייז די Buffer P2.אין דעם צייַט, ווייַס פלאָקקולאַנט אָפּזאַץ זאָל דערשייַנען.סענטריפיודזש ביי מער ווי וועגן 11,000 רפּם (12,000 × ג) פֿאַר 10-15 מינוט, קערפאַלי פּיפּט די סופּערנאַטאַנט אין אַ נייַ 50 מל ראָונד-דנאָ סענטריפודזש רער (זיך-צוגעגרייט), און ויסמיידןאַספּירירן די פלאָוטינג ווייַס אָפּזאַץ.
Δ לייג Buffer P4 און מיד יבערקערן צו מישן געזונט.לאָזן די רער שטיין ביז די ווייַס אָפּזאַץ איז פונאנדערגעטיילט יוואַנלי איבער די לייזונג צו פאַרמייַדן די פּראָדוקציע פון היגע אָפּזאַץ וואָס קען ווירקן נוטראַלייזינג.אויב עס איז קיין מונדיר ווייַס פלאָקקולאַנט אָפּזאַץ איידער סענטריפוגיישאַן און די סופּערנאַטאַנט איז נישט קלאָר נאָך סענטריפוגיישאַן, די רער קענען זייןסענטריפוגעד פֿאַר אנדערן 5 מין.
5. לייג 0. 1 מאל די באַנד (10% פון די סופּערנאַטאַנט באַנד, וועגן 2.2 מל) פון ענדאָטאָקסין סקאַוואַנדזשער צו די סופּערנאַטאַנט פון שריט 4 און יבערקערן צו מישן.שטעלן די לייזונג אין אַן אייז וואַנע אָדער אַרייַנלייגן אין קראַשט ייַז (אָדער פרידזשידער פריזער) פֿאַר 5 מינוט ביז די לייזונג ענדערונגען פון טורביד צו קלאָר און טראַנספּעראַנט (אָדער נאָך).אַ ביסל טורביד), און טייל מאָל מישן עטלעכע מאל.
Δ נאָך די ענדאָטאָקסין סקאַוואַנדזשער איז מוסיף צו די סופּערנאַטאַנט, די סופּערנאַטאַנט וועט ווערן טורביד אָבער דיסופּערנאַטאַנט זאָל ווערן קלאָר (אָדער אַ ביסל טורביד) נאָך קאָאָלינג אין די אייז וואַנע.
6. נאָך די סופּערנאַטאַנט איז געשטעלט אין צימער טעמפּעראַטור (>25 ℃) פֿאַר 10 - 15 מינוט, עס וועט ווערן טורביד וויזייַן טעמפּעראַטור ינקריסיז צו צימער טעמפּעראַטור.דעריבער די סופּערנאַטאַנט זאָל זיין ינווערטיד צו מישן.
Δ אויב צימער טעמפּעראַטור איז נידעריקער אָדער איר ווילן צו רעדוצירן יקסטראַקשאַן צייט, די סופּערנאַטאַנט קענען זיין ינקובייטיד אין אַ 37 ~ 42 ℃ וואַסער וואַנע פֿאַר 5-10 מינוט און דער ווייַטער שריט קענען זיין דורכגעקאָכט נאָך די סופּערנאַנטאַנטװערט טרויעריק.
7. סענטריפיודזש די סופּערנאַטאַנט ביי וועגן 11,000 רפּם (12,000 × ג) פֿאַר 10 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור (טעמפּעראַטור מוזן זיין> 25 ℃) צו באַזונדער די פאַסע.דער אויבערשטער ייקוויאַס פאַסע כּולל די דנאַ בשעת די נידעריקער בלוי ייליק פאַסע שיכטע כּולל ענדאָטאָקסין און אנדערע ימפּיוראַטיז.אַריבערפירן דידנאַ-מיט ייקוויאַס פאַסע צו אַ נייַ רער אוןאַוועקוואַרפן די ייליק שיכטע.
Δ די טעמפּעראַטור בעשאַס סענטריפוגיישאַן מוזן זיין איבער 25 ℃ ווי עפעקטיוו פאַסע צעשיידונג טוט נישטפאַלן אויב די טעמפּעראַטור איז צו נידעריק.
Δ אויב די פאַסע צעשיידונג איז נישט עפעקטיוו, די סענטריפוגאַטיאָן טעמפּעראַטור קענען זיין אַדזשאַסטיד צו 30 ℃ אוןדי צייט פון סענטריפוגיישאַן קענען זיין געוואקסן צו 15 מינוט.
Δ דו זאלסט נישט זויגן די בלוי ייליק שיכטע ווייַל עס כּולל ענדאָטאָקסין און אנדערע ימפּיוראַטיז.
מעקאַניזאַם
רעסאַספּענשאַן ליסיס נייטראַליזיישאַן
◇ לייג 7.5 מל Buffer P1
◇ לייג 7.5 מל באַפער פּ2
◇ לייג 7.5 מל באַפער פּ4
באַזייַטיקונג פון ענדאָטאָקסין
◇ לייג 0. 1 מאל די סופּערנאַטאַנט באַנד פון ענדאָטאָקסין סקאַוואַנדזשער
ביינדינג און וואַשינג
◇ לייג 0.5 מאל די באַנד פון יסאָפּראָפּאַנאָל
◇ לייג 10 מל Buffer PW
◇ לייג 10 מל Buffer PW
עלוציע
◇ לייג 1 - 2 מל באַפער טב אָדער ענדאָטאָקסין-פֿרייַ דדה2אָ
