וראַסיל דנאַ גליקאָסילאַסע
Uracil-DNA גליקאָסילאַסע (UNG אָדער UDG) איז אַ רעקאָמבינאַנט קלאָון פון E.coli מיט אַ מאָלעקולאַר וואָג פון 25 kDa.עס קאַטאַליזיז די מעלדונג פון פריי וראַסיל פון וראַסיל-מיט איין-סטראַנדיד און טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ, און איז ינאַקטיוו קעגן רנאַ, און קענען זיין געוויינט צו פאַרמייַדן קאַנטאַמאַניישאַן פון פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקטן.דער פּרינציפּ פון קאַמף איז באזירט אויף דעם פאַקט אַז אויב דוטפּ איז סאַבסטאַטוטאַד פֿאַר דטטפּ אין די פּקר אָפּרוף און אַ פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט מיט דו באַסעס איז געשאפן, די ענזיים קענען סאַלעקטיוולי ברעכן די גלייקאַסיד בונד פון ו באַסעס אין איין-סטראַנדיד און טאָפּל-סטראַנדיד. דנאַ און דיגרייד די פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט.
רעקאַמענדיד אַפּפּליקאַטיאָן
קאַנטאַמאַניישאַן פּרעווענטיאָן אַמפּלאַפאַקיישאַן
סטאָרידזש צושטאַנד
-20 ° C פֿאַר לאַנג-טערמין סטאָרידזש, זאָל זיין געמישט געזונט איידער נוצן, ויסמיידן אָפט פרירן-טאָ.
סטאָרידזש באַפער
20 מם טריס-הקל (pH 8.0), 150 מם נאַקל, 1 מם עדטאַ, 1 מם דטט, סטאַביליזער, 50% גליסעראָל.
אַפּאַראַט דעפֿיניציע
די סומע פון ענזיים פארלאנגט צו דיגרייד 1 μג פון איין-סטראַנדיד דנאַ מיט דו באַסעס אין 1 שעה ביי 37 ° C איז 1 אַפּאַראַט.
קוואַליטעט קאָנטראָל
1.SDS-PAGE ילעקטראָופאָרעטיק ריינקייַט העכער ווי 98%
2.אַמפּלאַפאַקיישאַן סענסיטיוויטי, פּעקל-צו-פּעקל קאָנטראָל, פעסטקייַט
3.נאָך 1U פון UNG איז באהאנדלט ביי 50 ℃ פֿאַר 2 מינוט, די מוסטער מיט U אונטער 103 עקזעמפלארן זאָל זיין גאָר דיגריידיד און קיין אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט קענען זיין געשאפן.
4.קיין עקסאָגענאָוס נוקלעאַסע טעטיקייט
אינסטרוקציעס
| קאַמפּאָונאַנץ | באַנד (μL) | לעצט קאַנסאַנטריישאַן |
| 10 × PCR Buffer (dNTP פריי, Mg²+פרייַ) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μם |
| dUTP (פאַרבייַטן dTTP) | - | 200-600 μם |
| 25 מם מגקל2 | 2-8 μל | 1-4 מם |
| 5 ו / μ ל טאַק | 0.25 | 1.25 יו |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 ו (0.1-0.5) |
| 25 × אָנפאַנגער מיקסא | 2 | 1× |
| מוסטער | - | ＜1μג / אָפּרוף |
| ddH₂O | צו 50 | - |
נאטיץ: אַ: אויב געניצט פֿאַר qPCR/qRT-PCR, די פלורעסאַנט זאָנד זאָל זיין מוסיף אין די אָפּרוף סיסטעם.וסואַללי, אַ לעצט אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן פון 0.2 μם קענען געבן גוט רעזולטאַטן;ווען דער אָפּרוף פאָרשטעלונג איז נעבעך, די אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן קענען זיין אַדזשאַסטיד אין די קייט פון 0.2-1 μם.יוזשאַוואַלי, די זאָנד קאַנסאַנטריישאַן איז אָפּטימיזעד אין די קייט פון 0.1-0.3 μM.קאַנסאַנטריישאַן גראַדיענט יקספּעראַמאַנץ קענען זיין געטאן צו געפֿינען די בעסטער קאָמבינאַציע פון אָנפאַנגער און זאָנד.
הערות
1.UNG ענזיים קענען ווערן גענוצט צו באַזייַטיקן די קאַנטאַמאַנייטאַד דוטפּ אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקטן פון די אָפּרוף סיסטעם איידער די פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן אָפּרוף, און צו ויסמיידן פאַלש-positive רעזולטאַטן רעכט צו פּראָדוקט קאַנטאַמאַניישאַן.
2.די אָפּטימאַל טעמפּעראַטור פֿאַר UNG ענזיים צו זיין געוויינט אין די אַנטי-קאַנטאַמאַניישאַן פּקר אָפּרוף איז בכלל 50 ℃ פֿאַר 2 מינוט;די ינאַקטיוויישאַן צושטאַנד איז 95 ℃ פֿאַר 5 מינוט.
3.ויסמיידן אָפט פרירן-טאָ, און טאָן ניט ויסשטעלן צו גרויס טעמפּעראַטור פלאַקטשויישאַנז.
4.פאַרשידענע גענעס צו זיין אַמפּלאַפייד האָבן פאַרשידענע יוטאַלאַזיישאַן עפעקטיווקייַט פון דוטפּ און סענסיטיוויטי צו UNG ענזיים, דעריבער, אויב די נוצן פון UNG סיסטעם פירט צו אַ פאַרקלענערן אין דיטעקשאַן סענסיטיוויטי, די אָפּרוף סיסטעם זאָל זיין אַדזשאַסטיד און אָפּטימיזעד, אויב איר דאַרפֿן טעכניש שטיצן, ביטע קאָנטאַקט אונדזער געזעלשאַפט.
