RTL פאַרקערט טראַנסקריפּציע
RTL פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע איז אַ רנאַ מוסטער-אָפענגיק דנאַ פּאָלימעראַסע וואָס פעלן די 3'→5' עקסאָנוקלעאַסע טעטיקייט און האט רנאַסע ה טעטיקייט.דער ענזיים קענען נוצן רנאַ ווי אַ מוסטער צו סינטאַסייז אַ קאַמפּלאַמענטשי שנירל פון דנאַ, וואָס קענען זיין געווענדט צו דער ערשטער-שנירל קדנאַ סינטעז, ספּעציעל פֿאַר RT-LAMP (שלייף-מעדיאַטעד יסאָטהערמאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן).קאַמפּערד מיט RTL פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע 1.0, די סענסיטיוויטי איז באטייטיק ימפּרוווד, די טערמאַל פעסטקייַט איז שטארקער, און דער אָפּרוף ביי 65 ° C איז מער סטאַביל.RTL פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע (גליסעראָל פריי) קענען זיין געוויינט צו צוגרייטן ליאָפילייזד פּרעפּעריישאַנז, ליאָפילייזד RT-LAMP רייידזשאַנץ עטק.
אַפּאַראַט דעפֿיניציע
איין אַפּאַראַט ינקאָרפּערייץ 1 נמאָל פון דטטפּ אין זויער-פּרעסיפּיטאַבלע מאַטעריאַל אין 20 מינוט ביי 50 ° C ניצן פּאָלי(א)•אָליגאָ(דט)25 ווי מוסטער-אָנפאַנגער.
קאַמפּאָונאַנץ
| קאָמפּאָנענט | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע (גליסעראָל-פריי) (15U/μL) | 0.1 מל | 1 מל | 10 מל |
| 10×HC RTL Buffer | 1.5 מל | 4 × 1.5 מל | 5 × 10 מל |
| MgSO4 (100 מם) | 1.5 מל | 2 × 1.5 מל | 3×10 מל |
סטאָרידזש צושטאַנד
טראַנספּאָרטאַטיאָן אונטער 0 ° C און זיין סטאָרד בייַ -25 ° C ~ -15 ° C.
קוואַליטעט קאָנטראָל
- רעזידענטשאַל טעטיקייט פוןEנדאָנוקלאַסע:א 50 μ ל אָפּרוף מיט 1 μג פון λ דנאַ און 15 וניץ פון RTL2.0 ינגקיובייטיד פֿאַר 16 שעה ביי 37 ℃ ווייזט די זעלבע מוסטער ווי נעגאַטיוו קאָנטראָל דורך געל עלעקטראָפאָרעסיס.
- רעזידענטשאַל טעטיקייט פוןעקסאָנוקלאַסע:א 50 μ ל אָפּרוף מיט 1 μג פון הינד Ⅲ דיידזשעסטיד λ דנאַ און 15 וניץ פון RTL2.0 ינגקיובייטיד פֿאַר 16 שעה ביי 37 ℃ ווייזט די זעלבע מוסטער ווי נעגאַטיוו קאָנטראָל דורך געל עלעקטראָפאָרעסיס.
- רעזידענטשאַל טעטיקייט פוןניקאסע:א 50 μ ל אָפּרוף מיט 1 μג פון סופּערקאָילעד pBR322 און 15 וניץ פון RTL2.0 ינגקיובייטיד פֿאַר 4 שעה ביי 37 ° C ווייזט די זעלבע מוסטער ווי נעגאַטיוו קאָנטראָל דורך געל עלעקטראָפאָרעסיס.
- רעזידענטשאַל טעטיקייט פוןרנאַסע:א 10 μ ל אָפּרוף מיט 0.48 μג פון MS2 רנאַ און 15 וניץ פון RTL2.0 ינגקיובייטיד פֿאַר 4 שעה ביי 37 ° C ווייזט די זעלבע מוסטער ווי נעגאַטיוו קאָנטראָל דורך געל עלעקטראָפאָרעסיס.
- E. קאָלי gדנאַ:געמאסטן מיטע.קאָליספּעציפיש HCD דיטעקשאַן קיץ, 15 וניץ פון RTL2.0 כּולל ווייניקער ווי 1E. קאָליגענאָמע.
רעאַקציע סעטאַפּ
cDNA סינטעז פּראָטאָקאָל
| קאַמפּאָונאַנץ | באַנד |
| מוסטער רנאַ א | אַפּשאַנאַל |
| אָליגאָ (דט) 18 ~ 25 (50 ועם) אָדער ראַנדאָם אָנפאַנגער מישן (60 ועם) | 2 μל |
| dNTP מיקס (10 מם יעדער) | 1 μל |
| רנאַסע ינכיבאַטער (40U/uL) | 0.5 μל |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μל |
| 10×HC RTL Buffer | 2 μל |
| נוקלעאַסע-פֿרייַ וואַסער | אַרויף צו 20 μ ל |
הערות:
1) די רעקאַמענדיד דאָוסאַדזש פון גאַנץ רנאַ איז 1ng ~ 1μג
2) די רעקאַמענדיד דאָוסאַדזש פון מרנאַ איז געווען 50 נג ~ 100 נג
טערמאָ-סייקלינג טנאָים פֿאַר אַ רוטין אָפּרוף:
| טעמפּעראַטור (°C) | צייַט |
| 25 °Ca | 5 מינס |
| 55 °C | 10 מינסb |
| 80 °C | 10 מינס |
הערות:
1) אויב ראַנדאָם אָנפאַנגער מיקס איז געניצט, אַ ינגקיוביישאַן שריט ביי 25 °C.
2) אויב ציל אָנפאַנגער מישן איז געניצט, אַ ינגקיוביישאַן שריט ביי 55 ° C פֿאַר 10 ~ 30 מינוט.
רט-לאַמפּ פּראָטאָקאָל
| קאַמפּאָונאַנץ | באַנד | לעצט קאַנסאַנטריישאַן |
| מוסטער רנאַ | אַפּשאַנאַל | ≥10 קאפיעס |
| dNTP מיקס (10 מם) | 3.5 μל | 1.4 מם |
| FIP/BIP אָנפאַנגער (25×) | 1 μל | 1.6 μM |
| F3/B3 אָנפאַנגער (25 ×) | 1 μל | 0.2 μם |
| LoopF/LoopB פּרימערז (25 ×) | 1 μל | 0.4 μM |
| רנאַסע ינכיבאַטער (40U/μL) | 0.5 μל | 20 ו / רעאַקטיאָן |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μל | 7.5 ו / רעאַקטיאָן |
| Bst V2 DNA פּאָלימעראַסע (8U/μL) | 1 μל | 8 ו / רעאַקציע |
| MgSO4 (100 מם) | 1.5 μל | 6 מם (גאַנץ 8 מם) |
| 10×HC RTL Buffer (אָדער 10×HC Bst V2 Buffer) | 2.5 μל | 1 × (2מם מג2+) |
| נוקלעאַסע-פֿרייַ וואַסער | אַרויף צו 25 μ ל | - |
הערות:
1) מישן דורך וואָרטעקסינג און סענטריפודזש בעקיצער צו זאַמלען.קעסיידערדיק טעמפּעראַטור ינגקיוביישאַן בייַ 65 ° C פֿאַר 1 שעה.
2) די צוויי באַפערז זענען ינטעראָפּעראַבלע און האָבן די זעלבע זאַץ.
הערות
1.טהיס פּראָדוקט וועט פאָרעם אַ ווייַס האַרט ווען סטאָרד בייַ -20 °C.נעמען עס אויס פון -20 ° C און שטעלן עס אויף אייז פֿאַר וועגן 10 מינוט.נאָך מעלטינג, עס קענען זיין געוויינט דורך שאַקינג און מיקסינג.
2. די cDNA פּראָדוקט קען זיין סטאָרד ביי -20 ° C אָדער -80 ° C אָדער געוויינט מיד פֿאַר פּקר אָפּרוף.
3. צו פאַרמייַדן רנאַסע קאַנטאַמאַניישאַן, ביטע האַלטן די יקספּערמענאַל געגנט ריין, און טראָגן ריין גלאַווז און מאַסקס בעשאַס אָפּעראַציע.
