M-MLV נעאָסקריפּט פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע
נעאָסקריפּט פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע איז אַ פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע באקומען דורך מיוטיישאַן זיפּונג פון די M-MLV דזשין פון Moloney murine לוקימיאַ ווירוס אָנהייב און אויסדרוק אין E.coli.דער ענזיים רימוווז RNase H טעטיקייט, האט העכער טעמפּעראַטור טאָלעראַנץ און איז פּאַסיק פֿאַר הויך-טעמפּעראַטור פאַרקערט טראַנסקריפּציע.דעריבער, עס איז נוציק פֿאַר ילימאַנייטינג די אַנפייוועראַבאַל יפעקץ פון רנאַ הויך-מדרגה סטרוקטור און ניט-ספּעציפיש סיבות אויף cDNA סינטעז, און האט העכער פעסטקייַט און פאַרקערט טראַנסקריפּציע סינטעז פיייקייט.דער ענזיים האט העכער פעסטקייַט און פאַרקערט טראַנסקריפּציע סינטעז פיייקייט.
קאַמפּאָונאַנץ
1.200 ו / μ ל נעאָסקריפּט פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע
2.5 × ערשטער-סטראַנד באַפער (אַפּשאַנאַל)
* 5 × ערשטער-סטראַנד באַפער טוט נישט אַנטהאַלטן דנטפּ, ביטע לייגן דנטפּס ווען פּריפּערינג די אָפּרוף סיסטעם
רעקאַמענדיד אַפּפּליקאַטיאָן
1.איין-שריט qRT-PCR.
2.RNA ווירוס דיטעקשאַן.
סטאָרידזש צושטאַנד
-20 ° C פֿאַר לאַנג-טערמין סטאָרידזש, זאָל זיין געמישט געזונט איידער נוצן, ויסמיידן אָפט פרירן-טאָ.
אַפּאַראַט דעפֿיניציע
איין אַפּאַראַט ינקאָרפּערייץ 1 נמאָל פון דטטפּ אין 10 מינוט ביי 37 ° C ניצן פּאָלי(א)•אָליגאָ(דט)25ווי מוסטער / אָנפאַנגער.
קוואַליטעט קאָנטראָל
1.SDS-PAGE ילעקטראָופאָרעטיק ריינקייַט מער ווי 98%.
2.אַמפּלאַפאַקיישאַן סענסיטיוויטי, פּעקל-צו-פּעקל קאָנטראָל, פעסטקייַט.
3.קיין עקסאָגענאָוס נוקלעאַסע טעטיקייט, קיין עקסאָגענאָוס ענדאָנוקלעאַסע אָדער עקסאָנוקלאַסע קאַנטאַמאַניישאַן
רעאַקציע סעטאַפּ פֿאַר ערשטער קייט רעאַקטיאָן לייזונג
1.צוגרייטונג פון דער אָפּרוף געמיש
| קאַמפּאָונאַנץ | באַנד |
| אָליגאָ (דט)12-18 אָנפאַנגער אָדער ראַנדאָם אָנפאַנגערא אָדער גענע ספּעציפיש פּרימערזb | 50 פּמאָל |
| 50 פּמאָל (20-100 פּמאָל) | |
| 2 פּמאָל | |
| 10 מם דנטפּ | 1 μל |
| מוסטער רנאַ | גאַנץ רנאַ≤ 5μג;mRNA≤ 1 μג |
| RNase-free dH2O | צו 10 μל |
הערות:אַ / ב: ביטע אויסקלייַבן פאַרשידענע טייפּס פון אָנפאַנגער לויט דיין יקספּערמענאַל באדערפענישן.
2.היץ בייַ 65 ° C פֿאַר 5 מינוט און קיל ראַפּאַדלי אויף אייז פֿאַר 2 מינוט.
3.לייג די פאלגענדע קאַמפּאָונאַנץ צו די אויבן סיסטעם צו אַ גאַנץ באַנד פון 20 μ ל און מישן דזשענטלי:
| קאַמפּאָונאַנץ | באנד (μל) |
| 5 × ערשטער-סטראַנד באַפער | 4 |
| נעאָסקריפּט פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע (200 ו / μ ל) | 1 |
| רנאַסע ינכיבאַטער (40 ו / μ ל) | 1 |
| RNase-free dH2O | צו 20 μל |
4. ביטע דורכפירן די אָפּרוף לויט די פאלגענדע טנאָים:
(1) אויב ראַנדאָם אָנפאַנגער איז געניצט, דער אָפּרוף זאָל זיין דורכגעקאָכט ביי 25 ℃ פֿאַר 10 מינוט, און דעמאָלט ביי 50 ℃ פֿאַר 30 ~ 60 מינוט;
(2) אויב Oligo dT אָדער ספּעציפיש אָנפאַנגער זענען געניצט, דער אָפּרוף זאָל זיין דורכגעקאָכט ביי 50 ℃ פֿאַר 30 ~ 60 מינוט.
5.היץ ביי 95 ℃ פֿאַר 5 מינוט צו ינאַקטיווייט נעאָסקריפּט פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע און פאַרענדיקן די אָפּרוף.
6.פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּראָדוקטן קענען זיין געוויינט גלייַך אין פּקר אָפּרוף און פלורעסאַנס קוואַנטיטאַטיווע פּקר אָפּרוף, אָדער סטאָרד אין -20 ℃ פֿאַר אַ לאַנג צייַט.
PCR Rווירקונג:
1.צוגרייטונג פון דער אָפּרוף געמיש
| קאַמפּאָונאַנץ | קאָנצענטראַציע |
| 10 × PCR Buffer (dNTP פריי, Mg²+ פריי) | 1× |
| דנטפּס (10 מם יעדער דנטפּ) | 200 μם |
| 25 מם מגקל2 | 1-4 מם |
| טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע (5 ו / μ ל) | 2-2.5 יו |
| אָנפאַנגער 1 (10 μם) | 0.2-1 μם |
| אָנפאַנגער 2 (10 μם) | 0.2-1 μם |
| מוסטערא | ≤10% ערשטער קייט רעאַקטיאָן לייזונג (2 μל) |
| ddH2O | צו 50 μל |
הערות:אַ: אויב צו פיל ערשטער קייט רעאַקציע לייזונג איז צוגעגעבן, די פּקר אָפּרוף קען זיין ינכיבאַטיד.
2.פּקר רעאַקציע פּראָצעדור
| טרעפּל | טעמפּעראַטור | צייַט | סייקאַלז |
| פאַר-דענאַטוראַטיאָן | 95℃ | 2-5 מינוט | 1 |
| דענאַטוראַטיאָן | 95℃ | 10-20 סעק | 30-40 |
| אַנילינג | 50-60℃ | 10-30 סעק | |
| פאַרלענגערונג | 72℃ | 10-60 סעק |
הערות
1.פּאַסיק פֿאַר פאַרקערט טראַנסקריפּציע טעמפּעראַטור אַפּטאַמאַזיישאַן אין די קייט פון 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.עס האט בעסער פעסטקייַט, איז פּאַסיק פֿאַר פאַרקערט טראַנסקריפּציע אַמפּלאַפאַקיישאַן פון הויך טעמפּעראַטור.אין דערצו, עס איז גינציק פֿאַר יפישאַנטלי גייט פארביי דורך קאָמפּלעקס סטראַקטשעראַל מקומות פון רנאַ.אויך, עסאיז פּאַסיק פֿאַר איין-שריט מולטיפּלעקס פלואָרעססענסע קוואַנטיטאַטיווע רט-פּקר דיטעקשאַן.
3.גוט קאַמפּאַטאַבילאַטי מיט פאַרשידן פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן ענזימעס און איז פּאַסיק פֿאַר הויך סענסיטיוויטי RT-PCR ריאַקשאַנז.
4.פּאַסיק פֿאַר הויך סענסיטיוויטי איין-שריט פלואָרעססענסע קוואַנטיטאַטיווע רט-פּקר אָפּרוף, יפעקטיוולי פֿאַרבעסערן די דיטעקשאַן קורס פון נידעריק קאַנסאַנטריישאַן פון טעמפּלאַטעס.
5.פּאַסיק פֿאַר קאַנסטראַקשאַן פון cDNA ביבליאָטעק.
