וואַקסיניאַ ווירוס קאַפּינג ענזיים
וואַקסיניאַ ווירוס קאַפּינג ענזיים איז דערייווד פון אַ רעקאָמבינאַנט E. קאָלי שפּאַנונג קאַריז די גענעס פֿאַר די וואַקסיניאַ קאַפּינג ענזיים.דער איין ענזיים איז פארפאסט פון צוויי סובוניץ (D1 און D12) און האט דריי ענזימאַטיק אַקטיוויטעטן (רנאַ טריפאָספאַטאַסע און גואַנילילטראַנספעראַסע דורך די D1 סובוניט און גואַנינע מעטהילטראַנספעראַסע דורך די ד12 סובוניט).וואַקסיניאַ ווירוס קאַפּינג ענזיים איז עפעקטיוו צו קאַטאַליזירן די פאָרמירונג פון היטל סטרוקטור, וואָס קענען ספּאַסיפיקלי צוטשעפּען די 7-מעטהילגואַנילאַטע קאַפּ סטרוקטור (מ 7 גפּפּ, קאַפּ 0) צו די 5 ′ סוף פון רנאַ.קאַפּ סטרוקטור (קאַפּ 0) פיעסעס אַ וויכטיק ראָלע אין מרנאַ סטייבאַלאַזיישאַן, אַריבערפירן און איבערזעצונג אין עוקאַריאָטעס.קאַפּינג רנאַ דורך ענזימאַטיק אָפּרוף איז אַן עפעקטיוו און פּשוט אופֿן וואָס קענען באטייטיק פֿאַרבעסערן די פעסטקייַט און איבערזעצונג פון רנאַ פֿאַר אין וויטראָ טראַנסקריפּציע, טראַנספעקשאַן און מיקראָינדזשעקשאַן.
קאַמפּאָונאַנץ
וואַקסיניאַ ווירוס קאַפּינג ענזיים (10 ו / μ ל)
10×קאַפּינג באַפער
סטאָרידזש טנאָים
-25 ~ 15 ℃ פֿאַר סטאָרידזש （ ויסמיידן ריפּיטיד פרירן-טאָ סייקאַלז）
סטאָרידזש באַפער
20 מם טריס-הקל (pH 8.0), 100 מם נאַקל,
1מם דטט, 0.1מם עדטאַ, 0.1% טריטאָן X-100, 50% גליסעראָל.
אַפּאַראַט דעפֿיניציע
איין אַפּאַראַט פון וואַקסיניאַ ווירוס קאַפּינג ענזיים איז דיפיינד ווי די סומע פון ענזיים פארלאנגט צו ינקאָרפּערייט 10 פּמאָל פון GTP אין אַ 80נט טראַנסקריפּט אין 1 שעה ביי 37 ° C.
קוואַליטעט קאָנטראָל
עקסאָנוקלאַסע:10U פון וואַקסיניאַ ווירוס קאַפּינג ענזיים מיט 1μג λ-הינדריי דיידזשעסטיד דנאַ ביי 37 ℃ פֿאַר 16 שעה ייעלדס קיין דערנידעריקונג ווי באשלאסן דורך אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס.
ענדאָנוקלאַסע:10 ו פון וואַקסיניאַ ווירוס קאַפּינג ענזיים מיט 1μג λ דנאַ ביי 37 ℃ פֿאַר 16 שעה ייעלדס קיין דערנידעריקונג ווי באשלאסן דורך אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס.
ניקאסע:10 ו פון וואַקסיניאַ ווירוס קאַפּינג ענזיים מיט 1 μg pBR322 ביי 37 ℃ פֿאַר 16 שעה גיט קיין דערנידעריקונג ווי באשלאסן דורך אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס.
RNase:10 ו פון וואַקסיניאַ ווירוס קאַפּינג ענזיים מיט 1.6μג MS2 רנאַ פֿאַר 4 שעה ביי 37 ℃ גיט קיין דערנידעריקונג ווי באשלאסן דורך אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס.
1.coli DNA:10U פון וואַקסיניאַ ווירוס קאַפּינג ענזיים איז סקרינד פֿאַר די בייַזייַן פון E. קאָלי גענאָמיק דנאַ ניצן TaqMan qPCR מיט פּרימערז ספּעציפיש פֿאַר די E. קאָלי 16S רRNA לאָקוס.די E. קאָלי גענאָמיק דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן איז ≤1 E. קאָלי גענאָמע.
2.באַקטיריאַל ענדאָטאָקסין: LAL-טעסט, לויט כינעזיש פאַרמאַקאָפּאָעיאַ יוו 2020 אַדישאַן, געל לימיט פּרובירן אופֿן, אַלגעמיין הערשן (1143).ענדאָטאָקסין אינהאַלט פון באַקטיריאַ זאָל זיין ≤10 אי.יו. / מג.
אָפּרוף סיסטעם און באדינגונגען
1. קאַפּינג פּראָטאָקאָל (רעאַקציע באַנד: 20 μל)
דער פּראָצעדור איז אָנווענדלעך צו די קאַפּינג אָפּרוף פון 10μג רנאַ (≥100 נט) און עס קענען זיין סקיילד לויט צו יקספּערמענאַל פאדערונגען.
איך) קאַמביין 10μג רנאַ און נוקלעאַסע-פֿרייַ ה2אָ אין אַ 1.5 מל מיקראָפיודזש רער צו אַ לעצט באַנד פון 15.0 μל.*10 × קאַפּינג באַפער: 0.5 ם טריס-הקל, 50 מם קקל, 10 מם מגקל2, 10 מם דטט, (25 ℃, ף 8.0)
2) היץ ביי 65 ℃ פֿאַר 5 מינוט נאכגעגאנגען דורך אייז וואַנע פֿאַר 5 מינוט.
3) לייג די פאלגענדע קאַמפּאָונאַנץ אין דער סדר ספּעסיפיעד
| Cבאאמטער | Vאָלום |
| דענאַטורעד רנאַ (≤10μג, לענג≥100נט) | 15 μל |
| 10 × קאַפּינג באַפער * | 2 μל |
| GTP (10 מם) | 1 μל |
| SAM (2 מם) | 1 μל |
| וואַקסיניאַ ווירוס קאַפּינג ענזיים (10 ו / μ ל) | 1 μל |
*10 × קאַפּינג באַפער: 0.5 ם טריס-הקל, 50 מם קקל, 10 מם מגקל2, 10 מם דטט, (25 ℃, ף 8.0)
4) ינקובאַטע בייַ 37 ° C פֿאַר 30 מינוט, רנאַ איז איצט קאַפּט און גרייט פֿאַר דאַונסטרים אַפּלאַקיישאַנז.
2. 5′ וואָקזאַל לייבלינג אָפּרוף (רעאַקציע באַנד: 20 μל)
דער פּראָטאָקאָל איז דיזיינד צו שילדערן רנאַ מיט אַ 5 'טריפאָספאַטע און עס קענען זיין סקיילד אַרויף לויט די פאדערונגען.די עפעקטיווקייַט פון פירמע ינקאָרפּעריישאַן וועט זיין ימפּאַקטיד דורך די מאָלאַר פאַרהעלטעניש פון RNA: GTP, ווי געזונט ווי די GTP אינהאַלט אין רנאַ סאַמפּאַלז.
1) קאַמביין די צונעמען סומע פון רנאַ און נוקלעאַסע-פריי ה 2 אָ אין אַ 1.5 מל מיקראָפיודזש רער צו אַ לעצט באַנד פון 14.0 μ ל.
2) היץ ביי 65 ℃ פֿאַר 5 מינוט נאכגעגאנגען דורך אייז וואַנע פֿאַר 5 מינוט.
3) לייג די פאלגענדע קאַמפּאָונאַנץ אין דער סדר ספּעסיפיעד.
| Cבאאמטער | Vאָלום |
| דענאַטורעד רנאַ | 14 μל |
| 10×קאַפּינג באַפער | 2 μל |
| GTP מיקס** | 2 μל |
| SAM (2 מם) | 1 μל |
| וואַקסיניאַ ווירוס קאַפּינג ענזיים (10 ו / μ ל) | 1 μל |
** GTP MIX רעפערס צו GTP און אַ קליין נומער פון מאַרקערס.פֿאַר די קאַנסאַנטריישאַן פון GTP, אָפּשיקןצו באַמערקונג 3.
4) ינקובאַטע ביי 37 ° C פֿאַר 30 מינוט, רנאַ 5′ סוף איז איצט לייבאַלד און גרייט פֿאַר דאַונסטרים
אַפּפּליקאַטיאָנס
1. קאַפּינג מרנאַ איידער איבערזעצונג אַסייז / אין וויטראָ איבערזעצונג
2. לאַבעלינג 5 'סוף פון מרנאַ
הערות אויף נוצן
1.באַהיצונג די לייזונג פון רנאַ איידער ינגקיוביישאַן מיט די וואַקסיניאַ קאַפּינג ענזיים רימוווז צווייטיק סטרוקטור אויף די 5 'סוף פון די טראַנסקריפּט.פאַרברייטערן די צייט צו 60 מינוט פֿאַר טראַנסקריפּץ מיט באַוווסט העכסט סטראַקטשערד 5 ענדס.
2. רנאַ געניצט פֿאַר קאַפּינג ריאַקשאַנז זאָל זיין פּיוראַפייד פריערדיק צו נוצן און סוספּענדעד אין נוקלעאַסע-פֿרייַ וואַסער.עדטאַ זאָל נישט זיין פאָרשטעלן און די לייזונג זאָל זיין פריי פון סאָלץ.
3. פֿאַר לייבלינג די 5' סוף, די גאַנץ GTP קאַנסאַנטריישאַן זאָל זיין אַרום 1-3 מאל די מאָלאַר קאַנסאַנטריישאַן פון מרנאַ אין דער אָפּרוף.
4. דער באַנד פון די אָפּרוף סיסטעם קענען זיין סקיילד אַרויף אָדער אַראָפּ לויט די פאַקטיש.
