PNGase F
פּעפּטייד-ען-גליקאָסידאַסע F (PNGase F) איז די מערסט עפעקטיוו ענזימאַטיק אופֿן פֿאַר רימוווינג כּמעט אַלע N-לינגקט אָליגאָסאַקטשאַרידעס פון גלייקאָפּראָוטינז.PNGase F איז אַן אַמידאַסע, וואָס קלעווז צווישן די ינער מערסט גלקנאַק און אַספּעראַדזשין רעזאַדוז פון הויך מאַננאָסע, כייבריד און קאָמפּלעקס אָליגאָסאַקטשאַרידעס פֿון N-לינגקט גלייקאָפּראָוטינז.
אַפּפּליקאַטיאָן
דעם ענזיים איז נוציק פֿאַר באַזייַטיקונג פון קאַרבאָוכיידרייט רעזאַדוז פון פּראָטעינס.
צוגרייטונג און באַשרייַבונג
| אויסזען | בלאַס פליסיק |
| פּראָטעין ריינקייַט | ≥95% (פֿון SDS-PAGE) |
| אַקטיוויטעט | ≥500,000 ו/מל |
| עקסאָגליקאָסידאַסע | קיין טעטיקייט קען זיין דיטעקטאַד (ND) |
| ענדאָגליקאָסידאַסע פ 1 | ND |
| ענדאָגליקאָסידאַסע פ 2 | ND |
| ענדאָגליקאָסידאַסע פ 3 | ND |
| ענדאָגליקאָסידאַסע ה | ND |
| פּראָטעאַס | ND |
פּראָפּערטיעס
| עק נומער | 3.5.1.52(רעקאָמבינאַנט פון מייקראָואָרגאַניזאַמז) |
| מאָלעקולאַר וואָג | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| יסאָעלעקטריק פונט | 8. 14 |
| אָפּטימום ף | 7.0-8.0 |
| אָפּטימום טעמפּעראַטור | 65 °C |
| די ספּעציפישקייט פון די סאַבסטרייט | קלעאַווינג גלייקאַסיד קייטן צווישן גלקנאַק און אַספּאַראַגינע רעזאַדוז פיג.1 |
| דערקענונג זייטלעך | N-לינגקט גלייקאַנז סייַדן מיט α1-3 פוקאָס פיג. 2 |
| אַקטיוואַטאָרס | דטט |
| ינכיבאַטער | SDS |
| סטאָרידזש טעמפּעראַטור | -25 ~-15 ℃ |
| היץ ינאַקטיוואַטיאָן | א 20 μL אָפּרוף געמיש מיט 1 μL PNGase F איז ינאַקטיווייטיד דורך ינגקיוביישאַן ביי 75 ° C פֿאַר 10 מינוט. |
פיגורע 1 סאַבסטרייט ספּעסיפיקאַטי פון PNGase F
פיגורע 2 דערקענונג זיצט פון PNGase F.
ווען די ינערלעך גלקנאַק רעזאַדוז זענען לינגקט צו α1-3 פוקאָסע, PNGase F קען נישט קלייוו N-לינגקט אָליגאָסאַקטשאַרידעס פון גלייקאָפּראָוטינז.דעם מאָדיפיקאַטיאָן איז פּראָסט אין געוויקסן און עטלעכע ינסעקט גלייקאָפּראָוטינז.
Cבאאמטע
|
| קאַמפּאָונאַנץ | קאָנצענטראַציע |
| 1 | PNGase F | 50 μל |
| 2 | 10 × גלייקאָפּרוטין דענאַטורינג באַפער | 1000 μל |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 μל |
| 4 | 10% נפּ-40 | 1000 μל |
אַפּאַראַט דעפֿיניציע
איין אַפּאַראַט (ו) איז דיפיינד ווי די סומע פון ענזיים פארלאנגט צו באַזייַטיקן> 95% פון די קאַרבאָוכיידרייט פון 10 μג פון דענאַטורעד רנאַסע ב אין 1 שעה ביי 37 ° C אין אַ גאַנץ אָפּרוף באַנד פון 10 μL.
רעאקציע באדינגונגען
1. צעלאָזן 1-20 μג פון גלייקאָפּראָוטעין מיט דייאָניזעד וואַסער, לייגן 1 μl 10 μגליקאָפּרעטעין דענאַטורינג באַפער און H2O (אויב נייטיק) צו מאַכן אַ 10 μl גאַנץ אָפּרוף באַנד.
2.ינגקיובייט בייַ 100 ° C פֿאַר 10 מינוט, קיל עס אויף אייז.
3.לייג 2 μל 10×GlycoBuffer 2, 2 μל 10% נפּ-40 און מישן.
4.לייג 1-2 μl PNGase F און H2אָ (אויב נייטיק) צו מאַכן אַ 20 μל גאַנץ אָפּרוף באַנד און מישן.
5.ינגקיובייט אָפּרוף ביי 37 ° C פֿאַר 60 מינוט.
6.פֿאַר SDS-PAGE אַנאַליסיס אָדער HPLC אַנאַליסיס.
