mRNA Cap2'-O-Methyltransferase
mRNA קאַפּ 2'-אָ-מעטהילטראַנספעראַסע איז דערייווד פון אַ רעקאָמבינאַנט E. קאָלי שפּאַנונג וואָס קאַריז די דזשין פֿאַר די וואַקסיניאַ מרנאַ קאַפּ 2 '-אָ-מעטהילטראַנספעראַסע.דער ענזיים מוסיף אַ מעטהיל גרופּע אין די 2'-O שטעלע פון דער ערשטער נוקלעאָטידע שכייניש צו די היטל סטרוקטור אין די 5'ענד פון די רנאַ. -0) ריזאַלטינג אין אַ קאַפּ-1 סטרוקטור.
די קאַפּ1 סטרוקטור קענען פאַרגרעסערן די איבערזעצונג עפעקטיווקייַט, ימפּרוווינג די אויסדרוק פון מרנאַ אין טראַנספעקשאַן און מיקראָינדזשעקשאַן יקספּעראַמאַנץ. דעם ענזיים ספּאַסיפיקלי ריקווייערז רנאַ מיט אַ מ7גפּפּן היטל ווי סאַבסטרייט.עס קען נישט נוצן RNA מיט pN, ppN, pppN אָדער GpppN אין די 5 'סוף.קאַפּעד רנאַ קענען זיין צוגעגרייט דורך ינ וויטראָ טראַנסקריפּציע ניצן קאַפּ אַנאַלאָג אָדער דורך ענזימאַטיק קאַפּינג מיט די וואַקסיניאַ קאַפּינג ענזיים.
קאַמפּאָונאַנץ
mRNA קאַפּ 2'-אָ-מעטהילטראַנספעראַסע (50 ו / μ ל)
10×קאַפּינג רעאַקטיאָן באַפער
סטאָרידזש
-25 ~ 15 ℃ פֿאַר סטאָרידזש (ויסמיידן ריפּיטיד פרירן-טאָ סייקאַלז)
סטאָרידזש באַפער
20 מם טריס-הקל (pH 8.0, 25 ℃), 100 מם נאַקל, 1 מם דטט, 0. 1 מם עדטאַ, 0. 1% טריטאָן X-100, 50% גליסעראָל.
אַפּאַראַט דעפֿיניציע
איין אַפּאַראַט איז דיפיינד ווי די סומע פון ענזיים פארלאנגט צו מעטהילאַטע 10 פּמאָלעס פון 80 נט קאַפּט רנאַ טראַנסקריפּט אין 1 שעה ביי 37 ° C.
קוואַליטי קאָנטראָל אַסייס
עקסאָנוקלאַסע:50U פון מרנאַ קאַפּ 2 ´-אָ-מעטהילטראַנספעראַסע מיט 1μג λ-הינד III דיידזשעסטיד דנאַ ביי 37 ℃ פֿאַר 16 שעה ייעלדס קיין דערנידעריקונג ווי באשלאסן דורך אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס.
ענדאָנוקלעאַס: 50 ו פון מרנאַ קאַפּ 2 ´-אָ-מעטהילטראַנספעראַסע מיט 1 μג λ דנאַ ביי 37 ℃ פֿאַר 16 שעה ייעלדס קיין דערנידעריקונג ווי באשלאסן דורך אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס.
ניקאסע: 50U פון מרנאַ קאַפּ 2 ´-אָ-מעטהילטראַנספעראַסע מיט 1μג פּבר322 ביי 37 ℃ פֿאַר 16 שעה ייעלדס קיין דערנידעריקונג ווי באשלאסן דורך אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס.
רנאַסע: 50U פון מרנאַ קאַפּ 2 ´-אָ-מעטהילטראַנספעראַסע מיט 1.6μג MS2 רנאַ פֿאַר 4 שעה ביי 37 ℃ ייעלדס קיין דערנידעריקונג ווי באשלאסן דורך אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס.
E. coli דנאַ: 50U פון mRNA קאַפּ 2 ´-אָ-מעטהילטראַנספעראַסע איז סקרינד פֿאַר די בייַזייַן פוןE. coli גענאָמיק דנאַ ניצן TaqMan qPCR מיט פּרימערז ספּעציפיש פֿאַר דיE. coli 16S rRNA לאָקוס.דיE. coli גענאָמיק דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן איז = 1E. coli גענאָמע.
באַקטיריאַל ענדאָטאָקסין: LAL-טעסט, לויט כינעזיש פאַרמאַקאָפּאָעיאַ יוו 2020 אַדישאַן, געל לימיט פּרובירן אופֿן, אַלגעמיין הערשן (1143).ענדאָטאָקסין אינהאַלט פון באַקטיריאַ זאָל זיין = 10 אי.יו. / מג.
אָפּרוף סיסטעם און באדינגונגען
1. קאַמביין אַ צונעמען סומע פון קאַפּעד רנאַ און רנאַסע-פֿרייַ ה 2 אָ אין אַ 1.5 מל מיקראָפיודזש רער צו אַ לעצט באַנד פון 16.0 μל.
2. היץ ביי 65 ℃ פֿאַר 5 מינוט נאכגעגאנגען דורך אַן אייז וואַנע פֿאַר 5 מינוט.
3. לייג די פאלגענדע קאַמפּאָונאַנץ אין דער סדר ספּעסיפיעד (פֿאַר מעטהילאַטיאָן פון קאַפּעד רנאַ
ווייניקער ווי 10
| קאָמפּאָנענט | באַנד |
| דענאַטורעד קאַפּט רנאַ | 16 μל |
| 10 קס קאַפּינג רעאַקציע באַפער * | 2 μל |
| SAM (4 מם) | 1 μל |
| mRNA קאַפּ 2'-אָ-מעטהילטראַנספעראַסע (50 ו / μ ל) | 1 μל |
| ddH2O | צו 20 μל |
*10 × קאַפּינג רעאַקציע באַפער: 500 מם טריס-הקל (pH 8.0, 25 ℃), 50 מם קקל, 10 מם מגקל2 、 10 מם דטט.
4. ינקובאַטע בייַ 37 ℃ פֿאַר 1 שעה (2 שעה פון ינגקיוביישאַן איז רעקאַמענדיד פֿאַר די ציל פראַגמענט ווייניקער ווי 200 נט).
אַפּפּליקאַטיאָנס
צו פֿאַרבעסערן mRNA אויסדרוק בעשאַס מיקראָינדזשעקשאַן און טראַנספעקשאַן יקספּעראַמאַנץ.
הערות אויף נוצן
1. איידער אָפּרוף, רנאַ זאָל זיין פּיוראַפייד און צעלאָזן אין נוקלעאַסע-פֿרייַ וואַסער, אַלע די סאַלושאַנז זאָל נישט אַנטהאַלטן קיין עדטאַ און ייאַנז.
2. עס איז רעקאַמענדיד צו היץ די מוסטער רנאַ ביי 65 ℃ פֿאַר 5 מינוט איידער דער אָפּרוף צו באַזייַטיקן די צווייטיק סטרוקטור אויף די 5 'סוף פון די טראַנסקריפּט.עס קען זיין עקסטענדעד צו 10 מינוט פֿאַר קאָמפּלעקס 5 '-וואָקזאַל סטרוקטור.
