טאָפּל-סטראַנדיד רנאַ (דסרנאַ) עליסאַ קיט
דעם קיט איז אַן ענזיים-לינגקט יממונאָסאָרבענט אַססייַ (עליסאַ) קאַפּלינג מיט ביאָטין-סטרעפּטאַווידין סיסטעם, פֿאַר קוואַנטיטאַטיווע מעזשערמאַנט פון דסרנאַ מיט לענג העכער 60 באַזע פּערז (בפּ), ראַגאַרדלאַס פון די סיקוואַנס.דער טעלער איז פאַר-קאָוטאַד מיט אַנטי-דסרנאַ אַנטיבאָדי.דסרנאַ פאָרשטעלן אין דער מוסטער איז מוסיף און ביינדז צו אַנטיבאָדיעס קאָוטאַד אויף די וועלז.און דעמאָלט ביאָטינילאַטעד אַנטי-דסרנאַ אַנטיבאָדי איז מוסיף און ביינדז צו דסרנאַ אין דער מוסטער.נאָך וואַשינג, HRP-סטרעפּטאַווידין איז מוסיף און ביינדז צו די ביאָטינילאַטעד אַנטי-דסרנאַ אַנטיבאָדי.נאָך ינגקיוביישאַן אַנבאַונד HRP-סטרעפּטאַווידין איז געוואשן אַוועק.דערנאָך TMB סאַבסטרייט לייזונג איז מוסיף און קאַטאַלייזד דורך HRP צו פּראָדוצירן אַ בלוי קאָליר פּראָדוקט וואָס איז פארענדערט אין געל נאָך אַדינג אַסידיק האַלטן לייזונג.די געדיכטקייַט פון געל איז פּראַפּאָרשאַנאַל צו די ציל סומע פון דסרנאַ קאַפּטשערד אין טעלער.די אַבזאָרפּשאַן איז געמאסטן ביי 450 נם.
אַפּפּליקאַטיאָן
דעם קיט איז פֿאַר קוואַנטיטאַטיווע מעזשערמאַנט פון ריזידזשואַל דסרנאַ.
קיט קאַמפּאָונאַנץ
|
| קאַמפּאָונאַנץ | HCP0033A-1 | HCP0033A-2 |
| 1 | עליסאַ מיקראָפּלאַטע | 8×6 | 8× 12 |
| 2 | ביאָטינילאַטעד דעטעקשאַן אַנטיבאָדי (100 קס) | 60μל | 120μל |
| 3 | Hrp-סטרעפּטאַווידין (100x) | 60μל | 120μל |
| 4 | דילוטיאָן באַפער | 15 מל | 30 מל |
| 5 | טמב סאַבסטרייט לייזונג | 6 מל | 12 מל |
| 6 | האַלטן סאַלושאַן | 3 מל | 6 מל |
| 7 | קאַנסאַנטרייטאַד וואַשינג באַפער (20 קס) | 20 מל | 40 מל |
| 8 | נאָרמאַל (UTP, 5ng/μL) | 7.5μל | 15μל |
| 9 | נאָרמאַל (פּUTP, 5ng/μL) | 7.5μל | 15μל |
| 10 | נאָרמאַל (N1-Me-pUTP, 5ng/μL) | 7.5μל | 15μל |
| 11 | נאָרמאַל (5-OMe-UTP, 5ng/μL) | 7.5μל | 15μל |
| 12 | STE Buffer | 25 מל | 50 מל |
| 13 | טעלער סעאַלער | 2 ברעקלעך | 4 ברעקלעך |
| 14 | ינסטרוקטיאָן מאַנואַל און קאָאַ | 1 קאָפּיע | 1 קאָפּיע |
סטאָרידזש און פעסטקייַט
1. פֿאַר אַניוזד קיט: די גאנצע קיט קען זיין סטאָרד בייַ 2 ~ 8 ℃ אין פּאָליצע לעבן.שטאַרק ליכט זאָל זיין אַוווידיד פֿאַר סטאָרידזש פעסטקייַט.
2. פֿאַר געוויינט ינווענטאַר: אַמאָל די מיקראָפּלאַטע איז געעפנט, ביטע דעקן אַניוזד וועלז מיט טעלער סילער און צוריקקומען צו די שטער טאַש מיט די דעסיקקאַנט פּאַק, פאַרשלעסלען די שטער טאַש און צוריקקומען צו 2 ~ 8 ℃ ווי באַלד ווי מעגלעך נאָך נוצן.אנדערע רייידזשאַנץ זאָל זיין אומגעקערט צו 2 ~ 8 ℃ ווי באַלד ווי מעגלעך נאָך נוצן.
מאַטעריאַלס פארלאנגט אָבער ניט סאַפּלייד
1. מיקראָפּלאַטע לייענער מיט 450±10נם פילטער (בעסער אויב קענען דעטעקט ביי 450 און 650 נם ווייוולענגט).
2. מיקראָפּלאַטע שייקער.
3. רנאַסע-פֿרייַ עצות און סענטריפודזש טובז.
אָפּעראַציע פלאָווטשאַרט
איידער איר אָנהייבן
1. ברענגען אַלע קיט קאַמפּאָונאַנץ און סאַמפּאַלז צו צימער טעמפּעראַטור (18-25 ℃) איידער נוצן.אויב די קיט וועט נישט זיין געוויינט אין איין מאָל, ביטע נעמען בלויז סטריפּס און רייידזשאַנץ פֿאַר די פאָרשטעלן עקספּערימענט, און לאָזן די רוען סטריפּס און רייידזשאַנץ אין די פארלאנגט צושטאַנד.
2. וואַש באַפער: צעפירן 40 מל פון 20 × קאַנסאַנטרייטאַד וואַש באַפער מיט 760 מל פון דייאָניזעד אָדער דיסטילד וואַסער צו צוגרייטן 800 מל פון 1 × וואַש באַפער.
3. נאָרמאַל: בעקיצער ומדריי אָדער סענטריפודזש די לאַגער לייזונג איידער נוצן.די קאַנסאַנטריישאַן פון פיר סטאַנדאַרדס צוגעשטעלט איז 5ng/μL.פֿאַר UTP און pUTP dsRNA סטאַנדאַרדס, ביטע צעפירן די לאַגער לייזונג צו 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL מיט STE באַפער צו ציען די נאָרמאַל ויסבייג.פֿאַר N1-Me-pUTP dsRNA סטאַנדאַרדס, צעפירן די לאַגער לייזונג צו 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL מיט STE באַפער צו ציען די נאָרמאַל ויסבייג.פֿאַר 5-OMe-UTP dsRNA נאָרמאַל, ביטע צעפירן די לאַגער לייזונג צו 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL מיט STE באַפער צו ציען די נאָרמאַל ויסבייג.מיר רעקאָמענדירן סטאַנדאַרדס קענען זיין דיילוטאַד ווי די פאלגענדע טשאַרץ:
|
N1-Me-pUTP דסRNA סטאַנדאַרדס | |||
|
ניין. |
Final Con. (pg/μל) | דילוטיאָן לימעד | |
| STE באַפער |
נאָרמאַל | ||
|
A
B C D E F G H | 100
2
1 0.5 0.25 0. 125 0.0625 0.0312 0 | 49μל
490μל
250μל 250μל 250μל 250μל 250μל 250μל 250μל | 1μל 5נג / μל נאָרמאַל 10μל 100פּג/μל לייזונג 250μל לייזונג א 250μל לייזונג ב 250μל לייזונג C 250μל לייזונג ד 250μL לייזונג E 250μל לייזונג F / |
| פֿאַר 5-OMe-UTP dsRNA נאָרמאַל | |||
|
ניין. |
Final Con. (pg/μל) | דילוטיאָן לימעד | |
| STE באַפער |
נאָרמאַל | ||
|
A
B C D E F G H |
100
4
2 1 0.5 0.25 0. 125 0.0625 0 |
49μל
480μל
250μל 250μל 250μל 250μל 250μל 250μל 250μל | 1μל 5נג/μל נאָרמאַל 20μל 100פּג/μל לייזונג 250μל לייזונג א 250μל לייזונג ב 250μל לייזונג C 250μל לייזונג ד 250μL לייזונג E 250μל לייזונג F / |
4. ביאָטינילאַטעד דיטעקשאַן אַנטיבאָדי און HRP-סטרעפּטאַווידין ארבעטן לייזונג: בעקיצער ומדריי אָדער סענטריפודזש די לאַגער לייזונג איידער נוצן.צעפירן זיי צו די אַרבעט קאַנסאַנטריישאַן מיט דיילושאַן באַפער.
5. TMB סאַבסטייט: אַספּירירן די נויטיק דאָוסאַדזש פון די לייזונג מיט סטעראַלייזד עצות און טאָן ניט דאַמפּ די ריזידזשואַל לייזונג אין די וויאַל ווידער.TMB סאַבסטרייט איז שפּירעוודיק צו ליכט, טאָן ניט ויסשטעלן TMB סאַבסטרייט צו ליכט פֿאַר אַ לאַנג צייַט.
ניצן פּראָטאָקאָל
1. באַשטימען די נומער פון סטריפּס פארלאנגט פֿאַר די אַססייַ.אַרייַנלייגן די סטריפּס אין די ראָמען פֿאַר נוצן.רימיינדינג טעלער סטריפּס וואָס זענען נישט געניצט אין דעם אַססיי זאָל זיין ריפּאַקט אין די זעקל מיט דעסיקקאַנט.נאָענט די זעקל טייטלי פֿאַר ריפרידזשערייטיד סטאָרידזש.
2. לייג 100μ ל יעדער פון דילושאַנז פון נאָרמאַל, ליידיק און סאַמפּאַלז אין די צונעמען וועלז.קאָווער מיט די טעלער סילער.ינגקיובייט פֿאַר 1 שעה אין צימער טעמפּעראַטור מיט שאַקינג ביי 500 רפּם.די סאַמפּאַלז זאָל זיין דיילוטאַד מיט STE באַפער צו די צונעמען קאַנסאַנטריישאַן פֿאַר פּינטלעך אַסיינמאַנט.
3. וואַשן שריט: אַספּיראַטע די לייזונג און וואַשן מיט 250μ ל וואַש באַפער צו יעדער געזונט און לאָזן עס שטיין פֿאַר 30 ס.אַוועקוואַרפן וואַשינג באַפער גאָר דורך סנאַפּינג די טעלער אַנטו אַבזאָרבאַנט פּאַפּיר.גאָר וואַש 4 מאל.
4. לייג 100μ ל ביאָטינילאַטעד דיטעקשאַן אַנטיבאָדי ארבעטן לייזונג אין יעדער געזונט.קאָווער מיט די טעלער סילער.ינגקיובייט פֿאַר 1 שעה אין צימער טעמפּעראַטור מיט שאַקינג ביי 500 רפּם.
5. איבערחזרן וואַשן שריט.
6. לייג 100μל HRP-סטרעפּטאַווידין ארבעטן לייזונג אין יעדער געזונט.קאָווער מיט די טעלער סילער.ינגקיובייט פֿאַר 30 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור מיט שאַקינג ביי 500 רפּם.
7. איבערחזרן וואַשן שריט ווידער.
8. לייג 100μL פון TMB סאַבסטרייט לייזונג אין יעדער געזונט.קאָווער מיט די טעלער סילער.ינגקיובייט פֿאַר 30 מינוט בייַ רט, באַשיצן פון ליכט.די פליסיק וועט ווערן בלוי דורך די אַדישאַן פון סאַבסטרייט לייזונג.
9. לייג 50μL פון האַלטן לייזונג אין יעדער געזונט.די פליסיק וועט ווערן געל דורך די אַדישאַן פון האַלטן לייזונג.דערנאָך לויפן די מיקראָפּלאַטע לייענער און גלייך מעסטן די 450 נם.
כעזשבן פון רעזולטאטן
1. דורכשניטלעך די דופּליקאַט רידינגז פֿאַר יעדער נאָרמאַל, קאָנטראָל און סאַמפּאַלז און אַראָפּרעכענען די דורכשניטלעך נול נאָרמאַל אָפּטיש געדיכטקייַט.בויען אַ נאָרמאַל ויסבייג מיט אַבזאָרפּשאַן אויף די ווערטיקאַל (Y) אַקס און דסרנאַ קאַנסאַנטריישאַן אויף די האָריזאָנטאַל (X) אַקס.
2. עס איז רעקאַמענדיד צו דורכפירן די כעזשבן מיט קאָמפּיוטער-באזירט ויסבייג-פּאַסן ווייכווארג אַזאַ ווי ויסבייג עקספּערט 1.3 אָדער ELISA Calc אין אַ 5 אָדער 4 פּאַראַמעטער ניט-לינעאַר פּאַסיק מאָדעל.
פאָרשטעלונג
1. סענסיטיוויטי:
נידעריקער שיעור פון דיטעקשאַן: ≤ 0.001פּג/μL (פֿאַר UTP-, PUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (פֿאַר 5-OMe-UTP-dsRNA).
נידעריקער שיעור פון קוואַנטיטאַטיאָן: 0.0156 פּג/μל (פֿאַר UTP-, pUTP-dsRNA), 0.0312 פּג/μL (פֿאַר N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg/μL (פֿאַר 5-OMe-UTP-dsRNA).
2. פּינטלעכקייַט: קוו פון ינטראַ-אַססייַ ≤10%, קוו פון ינטער-אַססייַ ≤10%
3. אָפּזוך: 80% ~ 120%
4. לינעאַריטי: 0.0156-0.5פּג/μל (פֿאַר וטפּ-, פּוטפּ-דסרנאַ) 0.0312-1 פּג/μל (פֿאַר נ 1-מע-פּוטפּ דסRNA), 0.0625-1 פּג/ μ ל (פֿאַר 5-אָמע-וטפּ-דסרנאַ).
קאָנסידעראַטיאָנס
1. TMB אָפּרוף טעמפּעראַטור און צייט איז קריטיש, ביטע קאָנטראָלירן זיי לויט די לימעד שטרענג.
2. אין סדר צו דערגרייכן גוט אַסעי רעפּראָדוסיביליטי און סענסיטיוויטי, געהעריק וואַשינג פון די פּלאַטעס צו באַזייַטיקן וידעפדיק אַנ-ריאַקטיד רייידזשאַנץ איז יקערדיק.
3. אַלע די רייידזשאַנץ זאָל זיין געמישט ונ דורך פריערדיק צו נוצן און ויסמיידן בומבלעס בעשאַס מוסטער אָדער רייידזשאַנץ אַדישאַן.
4. אויב קריסטאַלז האָבן געשאפן אין די קאַנסאַנטרייטאַד וואַש באַפער (20 קס), וואַרעם צו 37 ℃ און מישן דזשענטלי ביז די קריסטאַלז זענען גאָר צעלאָזן.
5. ויסמיידן אַסעסמאַנט פון סאַמפּאַלז מיט סאָדיום אַזידע (נאַנ3), ווי עס קען צעשטערן די HRP טעטיקייט ריזאַלטינג אין אונטער-אָפּשאַצונג פון די סומע פון דסרנאַ.
6. ויסמיידן רנאַסע קאַנטאַמאַניישאַן בעשאַס אַסעי.
7. דער נאָרמאַל / מוסטער, דיטעקשאַן אַנטיבאָדי און סאַ-הרפּ קענען אויך זיין געפירט אין רט אָן שאַקינג, אָבער דאָס קען פאַרשאַפן דיטעקשאַן סענסיטיוויטי פאַרקלענערן דורך איין-פאַרלייגן.אין דעם פאַל, מיר רעקאָמענדירן אַז UTP און PUTP דסRNA סטאַנדאַרדס זאָל זיין דיילוטאַד פֿון 2pg/μL, N1-Me-PUTP דסRNA סטאַנדאַרדס זאָל זיין דיילוטאַד פֿון 4pg/μL און 5-OMe-UTP dsRNA נאָרמאַל זאָל זיין דיילוטאַד פֿון 8pg/μL.אין דערצו, ינגקיובייט HRP-סטרעפּטאַווידין ארבעטן לייזונג פֿאַר 60 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.דו זאלסט נישט נוצן אַ קאָלבע שייקער, ווייַל די קאָלבע שייקער קען פירן צו אַ ומפּינקטלעך רעזולטאַט.
טיפּיש רעזולטאַט
1. נאָרמאַל ויסבייג דאַטן
| קאָנצענטראַציע (פּג/μל) | N1-Me-pUTP מאַדאַפייד דסרנאַ נאָרמאַל | ||
| OD450-OD650(1) | OD450-OD650(2) | דורכשניטלעך | |
| 2 | 2.8412 | 2.7362 | 2.7887 |
| 1 | 1.8725 | 1.9135 | 1.8930 |
| 0.5 | 1.0863 | 1.1207 | 1.1035 |
| 0.25 | 0.623 | 0.6055 | 0.6143 |
| 0.125 | 0.3388 | 0.3292 | 0.3340 |
| 0.0625 | 0.1947 | 0.1885 | 0.1916 |
| 0.0312 | 0. 1192 | 0.1247 | 0.1220 |
| 0 | 0.0567 | 0.0518 | 0.0543 |
2. נאָרמאַל ויסבייג כעזשבן
3. לייַנער דיטעקשאַן קייט: 0.0312- 1פּג/μל
| קאַנסאַנטריישאַן (פּג/μל) | OD450-OD650 |
| 1 | 1.8930 |
| 0.5 | 1.1035 |
| 0.25 | 0.6143 |
| 0.125 | 0.3340 |
| 0.0625 | 0.1916 |
| 0.0312 | 0.1220 |
